液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)中的研究進(jìn)展

鄭耀林，林秋鳳，楊 樂，周瑞錚，沈昌瑩，易華娟，吳佳鋒

（1.東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 東莞 523808；2.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東 廣州 510640）

食品安全事關(guān)民生福祉，應(yīng)切實(shí)加強(qiáng)食品安全監(jiān)管，用“四個(gè)最嚴(yán)”筑牢舌尖安全的每一道防線。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人民生活水平不斷提高，對(duì)動(dòng)物源性產(chǎn)品的需求量不斷增加，獸藥殘留問題也越來越受重視[1-2]。獸藥的合理使用可預(yù)防動(dòng)物疾病，促進(jìn)動(dòng)物生長，提高動(dòng)物源性食品產(chǎn)量和質(zhì)量，滿足人民群眾對(duì)肉類蛋白的攝取需求。然而，部分不法商販盲目追求經(jīng)濟(jì)效益，違背動(dòng)物生長規(guī)律，濫用獸藥，導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中獸藥殘留超標(biāo)問題時(shí)有發(fā)生，不僅危害人體健康，而且污染環(huán)境，給養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來極大挑戰(zhàn)[3-4]。

耐藥性反應(yīng)是最為常見的獸藥殘留危害，養(yǎng)殖過程中的不合理用藥或者未嚴(yán)格執(zhí)行休藥期規(guī)定均會(huì)導(dǎo)致獸藥在動(dòng)物源性食品中嚴(yán)重蓄積[5-6]。殘留藥物通過食物鏈富集作用在人體內(nèi)蓄積，產(chǎn)生耐藥反應(yīng)，嚴(yán)重威脅人們的身體健康和藥物治療效果[7-8]。因此，必須對(duì)動(dòng)物源性食品安全監(jiān)管提出更高要求，為獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展注入更強(qiáng)動(dòng)力。

目前，獸藥殘留的檢測(cè)技術(shù)主要依賴液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜[9-11]，因其出色的定性、定量能力和高靈敏響應(yīng)特點(diǎn)，被廣泛用于獸藥殘留檢測(cè)工作。但是，獸藥種類繁多，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)多樣，給獸藥殘留的監(jiān)管和檢驗(yàn)工作帶來極大挑戰(zhàn)[12]。一方面，現(xiàn)有的檢驗(yàn)方法多為對(duì)已知獸藥的定量分析，對(duì)動(dòng)物源性食品中未知獸藥的殘留風(fēng)險(xiǎn)卻難以評(píng)估[13-14]；另一方面，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)多樣，對(duì)檢驗(yàn)人員能力和設(shè)備性能提出了更高要求，雖然能夠相對(duì)準(zhǔn)確獲得檢驗(yàn)結(jié)果，但檢驗(yàn)效率卻大打折扣，檢驗(yàn)成本高昂，已無法滿足人民群眾日益增長的食品安全需求。

高分辨質(zhì)譜是近年來發(fā)展較快的檢測(cè)技術(shù)，能夠在單次分析中鑒別、定量和確認(rèn)復(fù)雜混合物中更多痕量級(jí)的化合物組成[15-16]，在不影響質(zhì)譜靈敏度、質(zhì)量分辨率或定量重現(xiàn)性的情況下，獲得極其可靠的分析結(jié)果，是食品安全[17-20]、代謝組學(xué)[21-23]、法醫(yī)毒理[24-25]、結(jié)構(gòu)解析[26-27]以及成分分析[28-29]等應(yīng)用領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文對(duì)2018—2021年液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)分析中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，以期為動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的快速篩查及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)參考和依據(jù)。

1 高分辨質(zhì)譜的種類及特點(diǎn)

高分辨質(zhì)譜是一種分辨率≥104半峰寬、質(zhì)量準(zhǔn)確度＜5×10－6的精確質(zhì)量分析器。化合物碎片離子進(jìn)入質(zhì)量分析器，在外加電磁場(chǎng)的作用下做特征運(yùn)動(dòng)，依靠各自強(qiáng)大的信號(hào)采集系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析軟件，獲得高質(zhì)量分辨率和高精度的全掃描數(shù)據(jù)，具備非靶向高通量篩查和定量分析未知化合物的能力[30-31]。高分辨質(zhì)譜按照質(zhì)量分析器種類可分為：磁質(zhì)譜（magnetic mass spectrometry，Magnetic MS）、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，F(xiàn)TICR MS）、飛行時(shí)間質(zhì)譜（time-of-flight mass spectrometry，TOF MS）以及靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（orbitrap mass spectrometry，Orbitrap MS）。4 種質(zhì)量分析器的技術(shù)特點(diǎn)及其應(yīng)用如表1所示。Magnetic MS技術(shù)經(jīng)典、成熟、定量能力卓越，但成本高昂、操作復(fù)雜等劣勢(shì)限制了其廣泛應(yīng)用。未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道將其用于獸藥殘留的檢測(cè)，常與氣相色譜串聯(lián)使用，多見于二噁英、多氯聯(lián)苯等多鹵取代的平面芳烴類化合物的檢測(cè)[32-33]。FTICR MS是分辨率更高、定性能力更好的軌道離子阱質(zhì)量分析器，但龐大的體積和高昂的維護(hù)成本限制其進(jìn)一步推廣使用，一般不用于獸藥殘留的檢測(cè)，常見于石油化工[34-35]、蛋白質(zhì)組學(xué)[36-37]、代謝組學(xué)[38-39]及中藥成分分析[40-41]等領(lǐng)域。TOF MS和Orbitrap MS是目前商品化普及率更高的質(zhì)量分析器，已被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域。

表1 高分辨質(zhì)量分析器的技術(shù)特點(diǎn)及其應(yīng)用Table 1 Technical features and application of HRMS

2 液相色譜-高分辨質(zhì)譜在獸藥殘留中的應(yīng)用

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)將液相色譜的高效分離特點(diǎn)與質(zhì)譜強(qiáng)大的定性能力完美結(jié)合，是評(píng)價(jià)動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的常規(guī)技術(shù)手段[46-47]。高分辨質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展彌補(bǔ)了三重四極桿質(zhì)譜在未知化合物檢索方面的不足，其強(qiáng)大的定性篩查能力為獸藥殘留的監(jiān)督檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供新的技術(shù)手段，是獸藥殘留風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和科學(xué)研究的熱點(diǎn)[48-49]。

2.1 液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜

液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜具有掃描速度快、靈敏度高、質(zhì)量范圍廣等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域[50]。如表2所示，王聰?shù)萚51]根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)和GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定的禁限用獸藥化合物，建立了包含117 種禁限用獸藥的標(biāo)準(zhǔn)篩查譜庫。該方法使用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)豬肉中多種類獸藥進(jìn)行篩查和確證，完成了實(shí)體標(biāo)準(zhǔn)品向電子標(biāo)準(zhǔn)品的轉(zhuǎn)化，通過標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)，實(shí)現(xiàn)了在無標(biāo)準(zhǔn)品條件下對(duì)豬肉中獸藥殘留進(jìn)行高通量篩查。該方法簡單、靈敏，對(duì)目標(biāo)化合物選擇性好，已成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。田懷香等[52]等采用高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，開發(fā)了一種生鮮乳中高通量的獸藥殘留篩查方法。該方法前處理摒棄傳統(tǒng)的固相萃取除雜方式，采用冷凍凈化除脂技術(shù)，不僅縮短了前處理時(shí)間，而且增強(qiáng)了目標(biāo)化合物的篩查效果。樣液經(jīng)液相色譜分離，可在18 min內(nèi)完成174 種獸藥化合物的快速檢測(cè)，大大提高了獸藥的篩查效率。Li Xiaowen等[31]基于高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜建立了141 種禁限用藥物篩查譜庫，并將其成功應(yīng)用到豬肉中獸藥殘留的高通量篩查確證。該方法探究了不同乙腈-水體積分?jǐn)?shù)對(duì)目標(biāo)化合物提取效果的影響，利用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）競爭性絡(luò)合基質(zhì)中的金屬離子，有效提高四環(huán)素類藥物的回收率，為獸藥殘留的快速篩查和定量檢測(cè)提供有益參考。Magalh?es等[53]建立豬肝中45 種抗生素的快速篩查方法，所有化合物在歐盟規(guī)定的最大殘留限量水平做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確度、精密度、回收率等方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果均符合歐盟2002/657/EC準(zhǔn)則要求。液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜在獸藥殘留檢測(cè)中的具體應(yīng)用見表2。

表2 液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用Table 2 Application of liquid chromatography-time of flight mass spectrometry in the detection of veterinary drug residues

2.2 液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜

Orbitrap MS是靜電場(chǎng)離子阱和傅里葉變換技術(shù)的結(jié)合，通過提供高質(zhì)量分辨率和高精度全掃描譜圖實(shí)現(xiàn)對(duì)未知化合物的篩查和確證，已成為動(dòng)物源性食品中獸藥殘留檢測(cè)的研究熱點(diǎn)[4]。于慧娟等[12]采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法，建立了魚蝦樣品中18 類共計(jì)200 種藥物殘留的快速篩查方法。該方法利用標(biāo)準(zhǔn)溶液收集了200 種藥物的保留時(shí)間、母離子質(zhì)荷比及子離子質(zhì)荷比等特征信息，并將其整合成藥物篩查數(shù)據(jù)庫。魚蝦樣品經(jīng)乙腈和乙酸乙酯超聲提取，固相萃取柱凈化，樣液經(jīng)液相色譜分離后進(jìn)入Orbitrap進(jìn)行全掃描，當(dāng)響應(yīng)超過閾值離子時(shí)自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)子離子掃描以獲取詳細(xì)碎片離子信息。通過標(biāo)準(zhǔn)譜圖檢索比對(duì)進(jìn)行定性確證，實(shí)現(xiàn)了在無標(biāo)準(zhǔn)品情況下對(duì)200 種藥物殘留進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，單針分析時(shí)間僅需22 min。趙善貞等[60]利用同位素稀釋和液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)開發(fā)了水產(chǎn)品中100 種獸藥同時(shí)定性、定量分析方法。該方法前處理結(jié)合基質(zhì)分散固相萃取和同位素稀釋技術(shù)，有效消除定量過程中基質(zhì)效應(yīng)的影響。與外標(biāo)法相比，同位素內(nèi)標(biāo)法在基質(zhì)效應(yīng)的控制和定性定量信息準(zhǔn)確性方面存在明顯優(yōu)勢(shì)。李云飛等[61]基于靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)建立了動(dòng)物源性食品中33 種獸藥殘留的檢測(cè)方法，并建立33 種獸藥化合物高分辨質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫，實(shí)現(xiàn)非靶向定性篩查。該方法標(biāo)準(zhǔn)庫定性確證匹配度高，僅在低含量時(shí)（10 μg/kg），響應(yīng)較低的硝基咪唑類化合物二級(jí)碎片豐度比存在較大偏差。Zhao Wentao等[62]建立了一種快速的獸藥殘留檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中155 種藥物的高通量篩查和定量測(cè)定。該方法定性準(zhǔn)確、靈敏度高，定量限低于常規(guī)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，為獸藥殘留的監(jiān)督檢驗(yàn)和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供新思路。液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜在獸藥殘留檢測(cè)中的具體應(yīng)用見表3。

表3 液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用Table 3 Application of liquid chromatography-electrostatic field orbitrap mass spectrometry in the detection of veterinary drug residues

乙腈具有良好的蛋白沉淀能力，是動(dòng)物源性食品（主要成分為蛋白質(zhì)）中獸藥提取的首選溶劑[13]。乙腈中酸的濃度對(duì)獸藥化合物的提取效率產(chǎn)生顯著影響，是優(yōu)化前處理方法的主要研究方向。此外，EDTA可與基質(zhì)中的金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，提高大環(huán)內(nèi)脂類[74]、四環(huán)素類[31]藥物的回收率。固相萃取作為經(jīng)典的除雜技術(shù)，仍是動(dòng)物源性食品在獸藥殘留檢測(cè)的常用凈化手段。QuEChERS法是近年發(fā)展較快的前處理方法，該方法通用、快速、高效的特點(diǎn)使其在獸藥殘留檢測(cè)中展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。研究者可根據(jù)不同的基質(zhì)和目標(biāo)化合物個(gè)性化定制需要的溶劑、鹽包和吸附劑等材料，方法應(yīng)用廣泛、可塑性強(qiáng)，更好地迎合了前處理向自動(dòng)化發(fā)展的趨勢(shì)。此外，功能化的石墨烯、碳納米管等新型納米材料也被作為吸附劑成功地應(yīng)用于獸藥的富集和凈化過程[50,66,71]，其超高比表面積和豐富的π-π吸附位點(diǎn)為獸藥化合物的高效富集提供更多可能，是前處理技術(shù)發(fā)展的重要方向。

色譜柱填料技術(shù)的快速發(fā)展提高了單位時(shí)間色譜峰容量，優(yōu)異的分離效果和狹窄的峰寬減少了化合物共流出的發(fā)生，為高分辨質(zhì)譜的檢測(cè)提供有利基礎(chǔ)。反相C18柱是獸藥殘留檢測(cè)最為常用的色譜柱，可實(shí)現(xiàn)絕大多數(shù)非極性獸藥的有效分離。而對(duì)于少部分極性獸藥，親水相互作用柱可能是更好的選擇。

高分辨質(zhì)譜能夠提供高質(zhì)量精度的全掃描數(shù)據(jù)，展現(xiàn)出卓越的定性分析能力。飛行時(shí)間質(zhì)譜掃描速度快，能夠提供高質(zhì)量的二級(jí)質(zhì)譜圖用于質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定。靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜質(zhì)量分辨率高，能夠獲得高精確度的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的檢測(cè)。從文獻(xiàn)報(bào)道的檢出限、回收率、精密度等方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果可以看出，高分辨質(zhì)譜技術(shù)在動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的高通量非靶向篩查檢測(cè)方面表現(xiàn)卓越，應(yīng)用前景廣闊。

3 結(jié)語

獸藥種類繁多，目前的監(jiān)督檢測(cè)手段受檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法制約，難以實(shí)現(xiàn)多種類高通量的獸藥篩查和定量分析，給動(dòng)物源性食品安全的監(jiān)管工作帶來不便和風(fēng)險(xiǎn)隱患。高分辨質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展給動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)篩查和定量檢測(cè)提供了新的思路，超高分辨率和質(zhì)量精度的質(zhì)量分析器使其在定性篩查方面表現(xiàn)卓越，能夠很好地彌補(bǔ)三重四極桿質(zhì)譜依賴標(biāo)準(zhǔn)品、寬泛性不足的弱點(diǎn)。然而，昂貴的設(shè)備價(jià)格和維護(hù)成本在一定程度上限制了液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)的普及推廣；此外，液相色譜-高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫仍處于高速發(fā)展階段，尚未形成國際認(rèn)可、通用統(tǒng)一、類似NIST的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。截止目前，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第197號(hào)-9-2019《畜禽血液和尿液中150 種獸藥及其他化合物鑒別和確認(rèn)液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜法》是唯一一個(gè)將高分辨質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用到獸藥殘留檢驗(yàn)領(lǐng)域的國家標(biāo)準(zhǔn)。隨著高分辨質(zhì)譜的普及應(yīng)用，高分辨質(zhì)譜庫日趨完善，分析軟件和工具更新升級(jí)，相信不遠(yuǎn)的將來會(huì)有越來越多簡單、快速、高通量的快篩方法被開發(fā)應(yīng)用到獸藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和日常監(jiān)督檢驗(yàn)中，為動(dòng)物源性食品的監(jiān)管和生產(chǎn)發(fā)展提供更加豐富、高效、科學(xué)的技術(shù)手段。