氣單胞菌群體感應及其抑制劑研究進展

涂明霞，劉 蕾，高 亮，張 穎，桂 萌,*，饒 瑜,*

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2.北京市農林科學院，北京市水產科學研究所，北京 100097）

氣單胞菌（Aeromonas）是一類革蘭氏陰性、兼性厭氧、一般具有運動性的細菌，其廣泛分布于淡水、河口、海灣、淤泥等水環境中。此外，氣單胞菌還廣泛存在于新鮮水產品中，是魚蝦等水產品的常見腐敗菌[1-3]，且大多數氣單胞菌是嗜冷菌，在水產品冷藏期間可以繼續生長。氣單胞菌是人類和動物的環境條件致病菌，氣單胞菌感染會引發胃腸炎、菌血癥和傷口感染等疾病[4]。

群體感應（quorum sensing，QS）是細菌通過分泌信號分子（也稱自誘導物（autoinducers，AI））調控相關基因表達從而適應環境的一種信號交流機制，其參與調控細菌生物發光、毒力因子合成、生物被膜、質粒的結合轉移、抗生素的合成等行為[5-6]。Nealson等[7]研究發現費氏弧菌（Vibrio fischeri）能介導生物發光QS，它也被認為是大多數革蘭氏陰性細菌QS的范式。QS在食品微生物生態學的建立和發展中發揮著重要作用[8]。Swift等[9]在嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）和殺鮭氣單胞菌（A.salmonicida）中分別鑒定到LuxRI的同源物AhyRI和AsaRI，證實了氣單胞菌中存在QS系統。許多研究報道QS存在于氣單胞菌并參與其表型和功能的調控，一些研究表明QS參與調控氣單胞菌的腐敗能力和毒力因子的產生[3,10-11]，提示可以通過抑制氣單胞菌QS系統解決其引起的腐敗和致病問題。

傳統抗菌化合物（如抗生素）是通過干擾細菌的必需功能，如DNA、膜、肽聚糖和蛋白質的合成殺死或抑制細菌。在水產養殖中經常使用抗生素控制細菌疾病，這會導致抗生素耐藥細菌的發展和傳播，因此需要不斷開發新的抗菌藥物抑制新興的抗性菌株[12]。QS抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSI）是一類只抑制微生物QS而不影響其生長的化合物的總稱。QSI的優點主要體現在其具有高度特異性，不會引發細菌耐藥性的增強；QSI還具有化學穩定性，并能抵抗各種宿主代謝系統的降解[13]。基于此，本文介紹氣單胞菌QS的種類及組成，并重點綜述植物來源、微生物和動物來源、化學合成3 類QSI對氣單胞菌QS系統抑制作用的研究進展，為氣單胞菌QSI的篩選和氣單胞菌防治提供參考。

1 氣單胞菌QS系統

氣單胞菌QS系統根據信號分子種類不同分為3 類：1）以N-酰基高絲氨酸內酯類化合物（N-acyl homoserine lactone，AHLs）為信號分子的AI-1系統；2）以4,5-二羥基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy 2,3-pentanedione，DPD）衍生物自發重排為信號分子的AI-2系統[8]；3）由QseBC雙組分轉導信號及響應的AI-3系統[14]。其中氣單胞菌QS系統類型報道最多的是AI-1系統，研究表明氣單胞菌的3 種QS系統之間存在相互作用，共同調節氣單胞菌的表型行為[15]。

1.1 氣單胞菌的AI-1系統

圖1 展示了嗜水氣單胞菌的A I-1 系統。根據細菌信號分子積累量不同，可將這一系統分為兩個階段，第一階段為自誘導階段（圖1A），此時嗜水氣單胞菌處于指數生長期，AhyI酶催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）和?；d體蛋白的?；王；鶄孺満铣葾HLs[14]。AHLs與其特異性受體蛋白AhyR結合，并作為ahyRI編碼基因的轉錄調節因子參與自誘導循環，進一步促進AHLs信號分子的合成[14]。AHLs可以在細胞膜上自由擴散，并在細胞外環境中積累。在嗜水氣單胞菌進入生長穩定期且當AHLs信號分子積累量達到一定閾值后，氣單胞菌會進入第二階段（圖1B），即細胞間激活階段。值得注意的是，與自誘導階段不同，AhyR/AHLs此時會負調控基因組ahyRI。胞外AHLs進入細胞后同感應蛋白AhyR形成AhyR/AHLs復合物以激活生物被膜和毒力相關基因轉錄表達[16]。胞外的外源長鏈AHLs和QSI也能與受體蛋白AhyR結合，對氣單胞菌AHLs形成競爭性抑制[14]。AI-1系統存在于絕大多數氣單胞菌中，如豚鼠氣單胞菌（A.caviae）[17]、殺鮭氣單胞菌[18]和維氏氣單胞菌（A.veronii）[19]等。近年來從水產品、植物和環境等不同樣本中獲取的氣單胞菌及其AI-1信號分子即AHLs種類和檢測方法如表1所示。氣單胞菌的AHLs的?；滈L度介于C4～C18，并且可以通過不飽和、甲基分支、氧代或羥基取代基修飾[14]，其中C4、C6及C8短鏈AHLs信號分子在氣單胞菌中最為常見。

表1 不同來源的氣單胞菌產生的AHLs類型Table 1 AHLs produced by Aeromonas species from different sources

圖1 氣單胞菌的AI-1 QS系統示意圖Fig.1 Schematic diagram of AI-1 QS system in Aeromonas

1.2 氣單胞菌的AI-2和AI-3系統

目前有關氣單胞菌QS系統的報道多集中于AI-1系統，對于AI-2和AI-3系統的報道較少。僅嗜水氣單胞菌[36]和殺鮭氣單胞菌[37]中發現了AI-2系統。AI-2信號分子合成途徑通常如圖2所示：1）S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）在甲基轉移酶的催化下生成中間產物S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosyl-homocysteine，SAH），S-腺苷高半胱氨酸核苷酶Pfs降解SAH生成S-核糖高同型半胱氨酸（S-ribosyl-homocysteine，SRH）[14]；2）LuxS酶催化SRH裂解成4,5-二羥基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD）[38]，DPD自發環化形成呋喃酮類衍生物；3）DPD與硼酸鹽反應形成AI-2分子[21]。

圖2 氣單胞菌的AI-2 QS系統示意圖Fig.2 Schematic diagram of AI-2 QS system of Aeromonas

達卡氣單胞菌SSU和嗜水氣單胞菌均具有AI-3系統，即QseBC系統，該系統編碼大腸桿菌QseBC的功能同源物[15,22]，但氣單胞菌自誘導合成AI-3信號分子的機制還有待進一步研究?；诖竽c桿菌AI-3系統推測了氣單胞菌的AI-3系統包含兩個核心成分（圖3），即反應調節因子QseB和傳感器蛋白QseC。AI-3信號分子與作為傳感器的跨膜蛋白QseC結合，QseC被AI-3信號激活后自動磷酸化，將信號傳遞給QseB[14]。磷酸化的QseB激活相關毒力基因的轉錄，并自動調節qseBC基因。

圖3 氣單胞菌的AI-3 QS系統示意圖Fig.3 Schematic diagram of AI-3 QS system of Aeromonas

2 氣單胞菌QSI研究進展

QS介導的細菌通訊可以通過多種方式被阻斷：1）阻斷信號分子的合成；2）信號分子的酶促降解；3）競爭或非競爭性與受體蛋白結合，最終抑制靶基因表達[39]。QSI是一類能阻斷細菌QS系統的化合物[40]，根據其來源的不同，可劃分為植物來源、微生物和動物來源以及化學合成QSI。

2.1 植物來源氣單胞菌QSI

植物是天然QSI的主要來源之一，包括藥用植物、蔬菜和食用水果。植物來源QSI最大的優點是安全性較高，特別是一些藥食同源性植物提取物[41]。近年來有關氣單胞菌植物源QSI及其QS抑制作用和機制如表2所示。其中部分植物源QSI的化學結構如圖4所示。植物源QSI對氣單胞菌QS的抑制作用表型包括游動、群集運動、蛋白酶產量、黏附能力、毒力基因的表達等[41]。在這些植物源QSI中，2(5H)-呋喃酮的作用機制研究最為清楚，它與嗜水氣單胞菌AHLs信號分子競爭性配對受體蛋白結合位點，弱化AHLs介導的調控[42]。生物被膜是包裹在由多糖、蛋白質、脂質和DNA組成的水合細胞外聚合物基質中的細菌細胞的聚集體，它的形成受到QS調節[43]。如表2所示，除迷迭香酸和丁香油外，多數植物源QSI能夠抑制氣單胞菌生物被膜的形成。大量資料證明，QS在許多病原微生物的生物被膜發育中起著重要作用，并觸發它們的耐藥性和毒力[44]。通過抑制生物被膜的形成，可以降低致病菌的致病性和毒性，如香芹酚與N-丁?；?L-高絲氨酸內酯競爭結合受體LuxR和AsaR來抑制殺鮭氣單胞菌生物被膜的形成，減少由殺鮭氣單胞菌引起的微生物污染和腐敗[45]。研究表明姜黃素脂質、歐洲栗提取物、鄰氨基苯甲酸甲酯可通過與LuxI蛋白相互作用阻斷大豆氣單胞菌AHLs信號分子的合成[46-48]。香蘭素、香芹酚和鄰氨基苯甲酸甲酯可通過干擾AHLs信號分子與受體蛋白的結合來抑制殺鮭氣單胞菌QS[49]。

圖4 氣單胞菌的植物來源QSI結構Fig.4 Chemical structures of plant-derived QSIs of Aeromonas

表2 植物源氣單胞菌QSI及其QS抑制作用Table 2 Inhibitory effect of plant-derived QSIs on QS of Aeromonas

2.2 微生物和動物來源氣單胞菌QSI

氣單胞菌的微生物和動物來源QSI如表3所示，它們多通過降解信號分子AHLs對QS進行阻斷，根據降解AHLs位點的不同，又可將這些QSI分為兩種類型：1）AHL內酯酶，催化AHL內酯環水解產生N-?；呓z氨酸從而破壞AHL結構，如芽孢桿菌產生的AiiAAI96可以催化水解維氏氣單胞菌LP-11產生的AHLs[63]；2）AHL酰胺酶，催化AHL的酰胺鍵水解并生成脂肪酸和高絲氨酸內酯，如豬腎中的Acylase I催化水解嗜水氣單胞菌的AHLs[64]。另外，還有一些微生物源QSI抑制機制尚不清楚，如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CY 1-1在與溫和氣單胞菌共培養時降低了溫和氣單胞菌短鏈AHLs的產量，抑制甚至破壞其生物膜結構，抑制其胞外蛋白酶活性、溶血活性、鐵載體合成和運動性[65]；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）能干擾嗜水氣單胞菌luxS基因和毒力基因的表達，減弱嗜水氣單胞菌對細胞因子誘導的殺傷細胞的細胞毒性[66]。

表3 氣單胞菌微生物和動物來源QSI及其QS抑制作用Table 3 Inhibitory effect of microbe-and animal-derived QSIs on QS of Aeromonas

2.3 化學合成氣單胞菌QSI

目前臨床上使用的抗生素多是以殺死微生物或抑制微生物的生長來控制病原微生物，由此導致了耐藥細菌比例增加，部分致病菌形成耐藥性[75]。致病性氣單胞菌通常采用抗生素進行治療和控制，這就會引起其抗生素耐藥性增加[76]。QSI多抑制病原體QS而不影響病原體的生長，因此利用QSI處理病原微生物不會增強其耐藥性，目前QSI已成為控制細菌感染藥物研發的新方向，但這類藥物的開發仍處在起步階段[76]。抑制氣單胞菌QS的合成類藥物如表4所示，這些化學合成QSI都能抑制氣單胞菌生物被膜的形成，其中烷基喹惡啉-2-(1H)-酮可以改變豚鼠氣單胞菌信號分子AHL的內酯部分[77]；頭孢他啶、1,10-癸二醇、脫氫乙酸鈉和乙基麥芽酚都能夠抑制氣單胞菌蛋白酶活性[78-81]，另外(－)-二甲基-2,3-鄰異丙亞基-L-酒石酸酯通過模擬AI-2信號分子競爭其結合位點抑制氣單胞菌QS，從而抑制氣單胞菌生物被膜的形成[36]。

表4 化學來源QSI及其QS抑制作用Table 4 Inhibitory effect of chemically synthesized QSIs on QS of Aeromonas

3 氣單胞菌QSI在水產品防腐和水產病害控制方面的應用與展望

3.1 水產品防腐

水產品腐敗主要由微生物相互作用引起，抑制微生物生長和調節微生物群組成可能是防止魚類和甲殼類水產品品質劣變的重要方法[82]。高濃度的鹽或糖以及多種化學添加劑可以有效延長水產品保質期，但這些傳統的抑菌防腐方法可能帶來健康問題。近年來研究顯示水產品腐敗可能與腐敗菌QS有關[17,24,83-85]，如大黃魚腐敗過程中，優勢腐敗菌波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）能產生并積累4 種二酮哌嗪類（diketopiperazines，DKPs）QS信號分子，將波羅的海希瓦氏菌接種到滅菌魚露中并添加DKPs后培養，魚露的總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量顯著增加，表明信號分子DKPs能增強波羅的海希瓦氏菌對魚露的腐敗能力[86]；此外，Christensen等[87]發現冷熏三文魚優勢腐敗菌變形斑沙雷氏菌（Serratia proteamaculans）B5a能產生AHLs信號分子3-氧代-己酰基高絲氨酸內酯（3-oxo-C6），缺失sprI基因（3-oxo-C6合成基因）的突變體中胞外蛋白酶、脂肪酶、幾丁質酶活性均受QS調控，以上研究結果表明通過阻斷腐敗菌QS可以抑制水產品腐敗。

一些QSI已被證實能夠延緩水產品腐敗，如外源添加5’-胞苷酸和5’-腺苷酸可以抑制熒光假單胞菌和希瓦氏菌細胞外蛋白酶、鐵載體和TVB-N的產生，延緩鮭魚片在低溫貯藏期間的腐敗過程[88]。Li Tingting等[89]發現肉桂醛可以抑制熒光假單胞菌TVB-N的產生，延長大菱鲆的貯藏期。

氣單胞菌廣泛分布于水環境中，因此魚蝦等水產品容易受到氣單胞菌污染，且較多研究表明低溫貯藏條件下大西洋鮭、鯛魚、鯉魚、草魚、白鰱、熱帶蝦、凡納濱對蝦等水產品的優勢腐敗菌為氣單胞菌[90-95]。在一些研究中氣單胞菌被證實具有分泌脂肪酶和蛋白酶能力[96]，且會引起水產品腐敗異味和氧化三甲胺含量減少[91]、TVB-N和腐胺等胺代謝物積累[24]。因此抑制水產品中氣單胞菌活性對預防水產品腐敗變質具有重要作用。鱘魚腐敗菌維氏氣單胞菌LP-11能夠產生4 種AHLs，維氏氣單胞菌LP-11與腐敗相關的生物學功能（如蛋白酶活性、運動性以及對糖類、氨基酸等營養物質的轉運能力）受QS調控[17,63]；Zhao Dandan等[24]研究發現通過外源添加C8信號分子可促進維氏氣單胞菌在魚糜中產生TVB-N和腐胺，說明氣單胞菌QS參與調控魚糜腐敗。利用氣單胞菌QSI延緩水產品腐敗的研究較少，有研究表明以AiiAAI96作為氣單胞菌QSI處理鱘魚肉，可抑制鱘魚肉腐敗菌維氏氣單胞菌LP-11的產蛋白酶活性和運動活性，延緩鱘魚肉的腐敗速率[63]。綜上，氣單胞菌QS在水產品腐敗中的作用和調控機制還有待進一步研究，氣單胞菌QSI在水產品防腐保鮮領域的應用潛力值得深入挖掘。

3.2 水產病害控制

氣單胞菌是水產養殖環境中頻繁暴發的主要病原體[50]，且嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌導致魚類患出血性敗血癥和癤病[97]。dos Reis Ponce-Rossi等[98]發現QS調控嗜水氣單胞菌水解酪蛋白、脂質、淀粉的活性以及β型溶血活性；Schwenteit等[99]發現等位基因交換構建的殺鮭氣單胞菌AsaI敲除突變體的毒性蛋白酶AsaP1和1 種細胞毒性因子表達受損；Rasch等[40]發現含硫AHL類似物會降低殺鮭氣單胞菌產生蛋白酶的能力。

微生物聚集形成生物膜也是水生生物致病的重要因素[67,100]。抑制生物膜的形成是對抗細菌感染的新策略之一，阻斷細菌QS有助于抑制生物膜形成，從而降低食源性疾病的發病率[44]。QSI能抑制病原菌毒力相關基因的表達，減弱水產養殖病原菌的毒力[101]。目前已有不少研究應用QSI抑制氣單胞菌生物膜和毒力因子的形成從而減少氣單胞菌引起的水產病害。Chu Weihua等[71]發現AHLs降解菌顯著降低了嗜水氣單胞菌YJ-1菌株對斑馬魚的致病性；Srinivasan等發現柚皮苷是嗜水氣單胞菌QSI，且能夠抑制嗜水氣單胞菌的毒力因子的表達和感染能力[50]；Natrah等[102]發現QSI肉桂醛保護沙丁魚幼魚免受嗜水氣單胞菌的侵襲。因此，氣單胞菌QSI在水產病害防治方面具有廣闊的開發和應用前景。

氣單胞菌是水產品常見腐敗菌和致病菌，通常具有AI-1類QS系統。氣單胞菌QS系統為預防和控制氣單胞菌危害提供了一種新策略。安全、綠色、高效的氣單胞菌QSIs具有廣闊的市場前景，且對水產品防腐保鮮和養殖病害防控具有深遠意義。