肌紅蛋白在加工貯藏過程中結構與功能特性的變化及其對肉制品色澤的影響研究進展

王甜甜，朱逸宸，謝 勇，周 凱，廖鮮艷，黃俊逸，徐寶才,*

（1.上海大學生命科學學院，上海 200444；2.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230601）

我國是世界上最大的肉類生產國，肉品總產量占世界總產量的1/3。國家統計局數據顯示，2020年我國肉類產量為7 748萬 t[1]。隨著生活水平的提高，人們越來越重視肉及肉制品的品質。肉的品質指鮮肉或肉制品的外觀及適口性，評價指標主要包括色澤、pH值、系水力、嫩度、多汁性和風味等[2]。其中，肉及肉制品的色澤是消費者在購買產品時判斷其品質的主要因素之一，其在一定程度上反映了肉品的安全性和商業價值。有研究報告指出，2019年美國因肉類顏色發暗、失去光澤等問題而造成的損失達30億美元，全球損失達142億美元[3]。

畜禽肌肉中蛋白質含量約為18%～20%，是肉中除水分外含量最高的組分，其主要分為鹽溶性的肌原纖維蛋白、水溶性的肌漿蛋白以及不溶的基質蛋白[4]。肌紅蛋白屬于肌漿蛋白，其對肉及肉制品的顏色起著決定性作用。肉色變化的本質是肌紅蛋白狀態的改變，包括脫氧肌紅蛋白（deoxymyoglobin，DeoxyMb）與氧結合形成氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OxyMb），氧合肌紅蛋白在空氣中氧化成高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）。在肉及肉制品加工貯藏過程中，一些理化因素的改變可能會影響肌紅蛋白的結構，肌紅蛋白內血紅素輔基與珠蛋白結合能力的改變可能會影響血紅素輔基中心卟啉鐵的價位，從而影響肌紅蛋白的氧化還原，繼而影響肉及肉制品顏色[5]。研究在加工和貯藏過程中不同處理方式對肌紅蛋白結構和功能特性的影響，不僅可以盡量避免肌紅蛋白功能特性的破壞，而且還能有目的地對肌紅蛋白進行修飾以產生或增強一些特性從而提升肉及肉制品的品質[6]。

本文將介紹肌紅蛋白的結構和功能特性，并綜述在肉及肉制品加工貯藏過程中影響肌紅蛋白結構穩定性和功能特性的物理、化學以及微生物等因素，以及這些因素對肉及肉制品色澤的影響，以期為肉制品的品質控制提供理論和技術支持。

1 肌紅蛋白的結構

肌紅蛋白是一種由珠蛋白和血紅素輔基組成的結合蛋白（圖1），主要存在于心肌和骨骼肌中。珠蛋白的分子質量約為17 kDa，包含150 個氨基酸殘基，其主鏈由8 段長短不一的α-螺旋組成。總體呈中空球狀結構，極性氨基酸殘基幾乎全部分布在球狀結構表面，使肌紅蛋白具有良好的水溶性，而非極性氨基酸殘基分布在球狀結構內部，形成疏水空穴[7]。在空穴中包埋著1 個由卟啉環和1 個二價鐵離子組成的血紅素輔基，鐵原子位于卟啉環中央。卟啉環平面上的氮原子與鐵原子形成4 個配位鍵，珠蛋白93位組氨酸殘基的咪唑環上的N原子與鐵原子形成第5個配位鍵。而鐵原子的第6個配位鍵處于“開放”狀態，可與氧氣結合，兩個保守氨基酸殘基（64位的組氨酸與68位的纈氨酸）位于鐵原子第6個配位鍵附近，中間的空隙恰好可容納一個氧氣分子。珠蛋白為血紅素提供了一個疏水空穴，避免二價鐵被氧化，以保證血紅素的氧合能力[8]。

圖1 肌紅蛋白結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of the structure of myoglobin

2 肌紅蛋白與肉及肉制品色澤的關系

肉及肉制品色澤是衡量肉制品品質的重要指標，也是消費者判斷肉制品是否新鮮的重要依據[9]。食用動物在屠宰充分放血后，其肌肉顏色主要受肌紅蛋白含量以及其氧化還原的狀態相對含量及分布的影響。天然肌紅蛋白的氧化還原狀態主要有3 種形式：DeoxyMb（紫紅色）、OxyMb（鮮紅色）、MetMb（棕褐色）[10]，且這3 種形式之間可以互相轉化。在剛屠宰的肉中，DeoxyMb中心鐵離子為二價，血紅素輔基第6位配體空缺（圖2A），此時肉呈現出紫紅色；在空氣中暴露一段時間后，鐵離子第6 配位與氧氣結合（圖2B），DeoxyMb逐漸被氧化為OxyMb，此時肉呈現出消費者喜愛的櫻桃紅色，如圖3 中反應1 所示；隨著在空氣中暴露時間延長或在溫度等因素影響下，血紅素輔基中的二價鐵被氧化成三價鐵，此時第6 配位與水分子結合（圖2C），OxyMb 被氧化成MetMb，肉色逐漸劣變，形成令人難以接受的灰褐色[11]，如圖3 中反應2 所示。然而，肌肉中存在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）-細胞色素B5還原酶系統，其主要機制是NADH-細胞色素B5還原酶在輔因子NADH 和細胞色素B5的參與下將三價鐵還原為二價鐵，即MetMb 被還原為DeoxyMb[12]，如圖3 中反應3 所示。一般來說，NADH-細胞色素B5還原酶的還原能力越強，肉色越穩定。有研究表明，存在足量NADH 的條件下，NADH-細胞色素B5還原酶活性得到維持，然而隨著底物和輔因子的消耗、宰后肌肉pH 值的下降以及線粒體結構完整性和功能特性的喪失，NADH 含量迅速下降[13]。為了增加宰后肌肉中有限的NADH含量，有學者向肌肉中添加各種三羧酸循環中間產物如丙酮酸鹽[14]、蘋果酸鹽[15]、乳酸鹽等[16]，這些中間產物能被線粒體和酶體系利用以補充消耗的NADH，用于參與MetMb 的還原[17]。此外，乳酸脫氫酶可以在乳酸和丙酮酸相互轉化過程中將NAD＋還原為NADH，因此可以通過增加乳酸脫氫酶的活力穩定肉色[18]。DeoxyMb空缺的第6配位還能與CO結合形成亮紅色的碳氧肌紅蛋白[19]，或與NO結合形成亞硝基肌紅蛋白，分別如圖3中反應4、5所示。

圖2 不同狀態的肌紅蛋白結構示意圖及卟啉環平面結構圖Fig.2 Schematic diagrams of the structures and planar porphyrin rings of three forms of myoglobin

圖3 肌紅蛋白不同氧化還原狀態之間的轉化Fig.3 Interconversion of different redox states of myoglobin

肌紅蛋白結構十分保守，但是不同物種、同一物種不同品種以及同一動物不同部位的肉色差異較大，這是由于肌紅蛋白含量的不同[20]。Ragucci等[21]通過比較麝牛、水牛和黃牛的肌紅蛋白結構發現，三者肌紅蛋白氨基酸序列具有高度同一性，僅存在部分氨基酸殘基的置換，其二級結構具有高度保守性。王麗莎等[22]研究雜交豬種群中豬肉肌紅蛋白含量與肉色的相關性，發現肌紅蛋白含量較高的豬肉具有更好的肉色，這是由于肌紅蛋白含量高的肉類具有較多的I型和IA型纖維，該類型肌纖維比例較高的肌肉具有更好的肉色以及肉色穩定性。

在肉及肉制品加工貯藏過程中，溫度、時間、光照、加工手段等因素均會降低肌紅蛋白結構穩定性，導致珠蛋白與血紅素的結合能力變差，血紅素鐵被氧化，MetMb逐漸積累，肉色最終變成令人不悅的灰褐色[23]。因此，在肉及肉制品加工貯藏過程中通常會采用物理、化學以及微生物措施以維持肌紅蛋白結構穩定性，從而改善肉色劣變的問題。

3 物理因素引起的肌紅蛋白結構變化及其對肉制品色澤的影響

3.1 氧分壓

從鮮肉切面可以看到與空氣接觸的肉表層呈現OxyMb的鮮紅色，其內部由于氧分壓低（＜1.4 mmHg）呈現出DeoxyMb的紫紅色，表層和下層的中間呈棕褐色[24]。這是由于將鮮肉置于空氣中，肉表面與氧氣大量接觸生成鮮紅色的OxyMb，氧氣由肉表面逐漸向內部擴散，由于肌肉內部氧氣分壓較低，肌紅蛋白與氧氣的結合急劇下降，新合成的OxyMb也會逆向轉化為DeoxyMb。隨著貯藏時間進一步延長，肉表層和內部的氧分壓逐漸提高，肌紅蛋白中的Fe2＋被氧化成Fe3＋，形成MetMb，且氧分壓在5～7 mmHg時氧化速率最快，肉色呈現令人不悅的棕褐色[25]。

3.2 溫度

大部分肉及肉制品都要經過加熱后才能食用，加熱會改變肌紅蛋白的結構和理化性質，從而影響肉及肉制品的品質。未經腌制的肉在加熱后，肌紅蛋白中的珠蛋白發生部分變性，珠蛋白與血紅素輔基的結合能力降低，此時血紅素輔基有可能從疏水空穴中暴露，血紅素鐵迅速被氧化，生成黃褐色至灰色的MetMb，稱為高鐵血色原[26-27]。朱姝冉等[28]利用光譜技術分析加熱對肌紅蛋白結構的影響，結果表明隨著加熱溫度的升高，肌紅蛋白的二級結構和三級結構被嚴重破壞，血紅素逐漸解離，且該過程不可逆。王琳可[29]發現，加熱初期MetMb比例顯著升高，OxyMb比例逐漸減少，隨后3 種形式的肌紅蛋白比例逐漸達到平衡，其中80 ℃為肌紅蛋白狀態發生轉變的關鍵溫度，95 ℃則為其轉化完全達到平衡狀態的溫度。當肉中添加亞硝酸鹽腌制時，肌紅蛋白與NO結合生成難以解離且顏色鮮艷的一氧化氮肌紅蛋白。當加熱時，雖然珠蛋白仍會發生部分變性，但由于NO與血紅素難解離，生成一氧化氮肌紅蛋白，使肉及肉制品呈現出相對穩定的粉紅色。然而在貯存過程中由于光照、溫度、pH值等環境因素的作用會導致NO從一氧化氮肌紅蛋白上脫離，后者再被氧化為MetMb，導致產品色澤變差，影響其商業價值[30]。

低溫貯藏是目前肉及肉制品生產流通銷售過程中最常用的保鮮方法。根據貯藏溫度不同，低溫貯藏可分為冷藏（0～8 ℃）、冰溫貯藏（0 ℃至冰點）、超冰溫貯藏（冰點至過冷點）和凍藏（≤－18 ℃）[31]。Wang Zhaoming等[32]研究在冷藏（（4±1）℃）和超冰溫貯藏（（－3.5±0.5）℃）條件下兔肉中亞鐵肌紅蛋白的氧化速率，結果表明，與冷藏相比，超冰溫貯藏可以一定程度降低肌紅蛋白的氧化速率，這是由于肌紅蛋白的自氧化是一級反應，其氧化速率隨著貯藏溫度的降低而降低。Li Xin等[33]研究不同貯藏溫度對羊肉顏色穩定性影響，發現與4 ℃貯藏羊肉相比，在受控冰點（－0.8 ℃）下貯藏10 d羊肉的MetMb還原酶活力以及NADH含量更高，因此表現出更好的顏色穩定性。在實際生產過程中，由于冷鏈技術不完善，由溫度波動引起的肉及肉制品反復凍融的現象時有發生。研究表明，凍融循環會導致肉色劣變，一方面，由于凍融期間肉中冰晶的反復形成破壞了肌細胞結構的完整性，破碎的細胞器釋放大量的內源酶（脂肪酶、蛋白酶等）以及促氧化劑等，從而誘導肌紅蛋白的氧化，導致MetMb不斷生成，加速肉色劣變[34]；另一方面，溫度波動造成肌肉細胞的機械損傷，導致線粒體通過電子傳遞鏈介導MetMb的還原以及通過消耗氧氣維持肉色穩定性的途徑受阻，因此對MetMb的還原能力下降，導致MetMb的積累，最終影響肉及肉制品的品質[35]。

3.3 光照

3.4 物理加工

輻照保鮮是一種冷殺菌技術，高能電子束作用于食品原料及包裝食品產生的射線和自由基可以殺死微生物和滅活引起食品變質的酶，從而有效延長肉及肉制品的貨架期[37]。Nam等[38]使用不同劑量的電子束輻照真空包裝火雞雞胸肉，發現輻照會產生CO，CO與肌紅蛋白空缺的第6位配體結合形成亮紅色的COMb，從而賦予火雞雞胸肉令人喜愛的顏色。然而也有研究發現，高劑量輻照會促進自由基的產生，將OxyMb氧化為MetMb，還會破壞肌肉中線粒體結構的完整性，進而影響MetMb的還原，從而造成MetMb的積累，導致肉色變差[39]。此外，高劑量輻照會導致肌紅蛋白二級結構發生變化，使α-螺旋轉化為β-折疊或無規卷曲，導致肌紅蛋白結構穩定性下降和血紅素輔基的暴露[40]。

超高壓技術又稱高靜水壓技術，通過高壓影響食品分子的非共價鍵，破壞微生物的細胞膜，抑制酶活力，達到延長食品貨架期的作用[41]。已有研究表明，適當的壓力處理有利于肉色的維持，而壓力過高時會使肉品顏色變差。Hendrickx等[42]將此現象解釋為適當的壓力使酶活性中心凝聚，酶與基質接觸更充分，MetMb還原酶的活性增強；隨著壓力升高，酶的結構遭到破壞，MetMb還原酶活性逐漸降低。Carlez等[43]認為，高壓導致肉品變色的機制可能有兩點：高壓導致肌紅蛋白變性，鐵原子被釋放；以及高壓使OxyMb氧化為MetMb。馬漢軍等[44]通過研究不同壓力對碎牛肉顏色及肌紅蛋白的影響證實了上述結論，發現隨著壓力的增大，牛肉亮度值逐漸增加，紅度值逐漸下降，黃度值基本保持不變；當壓力達到400 MPa以上時，MetMb含量急劇上升。此外，加壓會破壞肌紅蛋白分子內氫鍵，導致肌紅蛋白部分展開，形成一種介于天然蛋白和完全展開狀態之間的中間形態，稱為熔融小球形態，使肌紅蛋白結構穩定性降低[45]。

干燥是肉干生產的關鍵工藝。謝小雷等[46]從肌紅蛋白含量和參與其構成的血紅素鐵含量兩方面研究不同干燥方式對牛肉干色澤的影響，發現與熱風干燥相比，中紅外-熱風組合干燥能夠減緩肌紅蛋白的氧化，增加OxyMb和血紅素鐵的含量，降低MetMb含量，使牛肉干具有更好的色澤。

3.5 包裝方式

目前常用的肉及肉制品包裝方式有氣調包裝、托盤包裝、真空包裝和活性包裝[47]。氣調包裝通過改變氣體成分與比例對肉及肉制品進行保鮮與護色，常見的填充氣體包括O2、CO2、CO、N2。高體積分數的氧氣可以將肌紅蛋白氧化成OxyMb，賦予肉及肉制品鮮艷的顏色[48]。然而，高氧氣調包裝可能會導致脂質與蛋白質發生過度氧化，從而對肌紅蛋白產生負面影響[49]。因此，目前多采用O2和CO2或N2結合的混合氣體填充方式，在保證肉色的同時發揮抑菌效果。CO通過與肌紅蛋白結合形成鮮紅色的碳氧肌紅蛋白從而賦予肉及肉制品鮮艷的顏色[50]，但由于CO存在潛在毒性，因此僅有少數國家允許使用。托盤包裝操作簡單、成本低廉，是目前肉及肉制品銷售終端最常見的一種包裝方式，但由于肉制品在該包裝條件下易發生脂肪和蛋白質氧化，導致肉色穩定性較差，因此貨架期較短[51]。真空包裝能有效抑制好氧微生物的生長，降低脂肪和蛋白質氧化速率，但抽真空會擠壓肉制品，造成嚴重的汁液流失，且因未接觸氧氣，肉品多以DeoxyMb的紫紅色呈現，導致消費者接受程度較低[52]。活性包裝能夠將包材內的抗氧化劑、抑菌劑等活性成份釋放到肉及肉制品表面，從而達到抑制肌紅蛋白氧化、維持肉色、延長保質期的目的，但由于成本高且活性材料的毒性評估難等因素限制了其廣泛應用[53]。

4 化學因素引起的肌紅蛋白結構變化及其對肉制品色澤的影響

4.1 pH值

在動物死后24～36 h內，肌肉組織中的主要代謝活動是糖酵解，乳酸的不斷積累導致pH值下降。研究表明，較低的pH值環境會加速肌紅蛋白氧化，這是由于pH值會影響珠蛋白三級結構，特別是血紅素周圍的局部區域。低pH值時珠蛋白三級結構打開，血紅素暴露于環境中導致其穩定性下降，且較低的pH值會加速結合氧的質子化，有利于超氧陰離子的釋放[54-55]。Qian Yidan等[56]利用電化學方法研究溶液中pH值誘導肌紅蛋白的血紅素結構改變，結果表明，在中性條件下血紅素基團位于血紅蛋白中心，被疏水性氨基酸（如Val 68、Phe 46和Leu 29）和極性組氨酸基團（His 93、His 64和His 97）包圍，在酸性（pH 3）或堿性溶液（pH 11）中，由于Fe-His 93的配位鍵斷裂，血紅素基團從疏水口袋中解離，使該基團暴露于溶液中，更易受到環境因素的影響。

4.2 硝基化

亞硝酸鹽是肉及肉制品加工過程中常用的發色劑。根據GB 2760—2011《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》的規定，肉制品中亞硝酸鹽的最高添加量為150 mg/kg。過量添加亞硝酸鹽存在致癌風險[57]。亞硝酸鹽在肉中的呈色機理分為3 步：首先，亞硝酸鹽在酸性條件下形成亞硝酸；然后，亞硝酸不穩定，在腌制過程中與還原物質作用生成NO；最后，NO再與還原性肌紅蛋白結合形成亞硝基肌紅蛋白（NOMb），從而賦予肉制品鮮艷的紅色。具體反應方程如下[58]：NaNO3→NaNO2＋2H2O、NaNO2+CH3CHOHCOOH→HNO2＋CH3CHOHCOONa、2HNO2→2NO＋H2O、NO＋Mb→NOMb。

Ma Guoyuan等[59]研究發現低劑量的亞硝酸鈉能夠減緩氧化導致的肌紅蛋白血紅素卟啉環的擴張，維持其結構穩定。臧容宇等[60]研究亞硝酸鈉在抑制牛肌紅蛋白介導的脂質氧化中的作用證實了上述發現，結果表明亞硝酸鈉的添加減少了肌紅蛋白中非血紅素鐵的釋放和卟啉的降解。然而，肉及肉制品中亞硝酸鈉殘留的危害作用使研究者尋找其他物質代替亞硝酸鹽發色。目前已開發出著色穩定、安全性高，具有抗氧化、抗菌活性的亞硝基血紅蛋白替代亞硝酸鹽發色，在降低肉及肉制品中亞硝酸鈉殘留的同時，有效利用禽畜血液資源，減少環境污染[61]。亞硝基血紅蛋白是血紅蛋白在一定條件下與亞硝酸鈉或NO反應的產物，亞硝基血紅蛋白分解釋放出NO－，肌紅蛋白繼續與NO－結合生成穩定的亞硝基肌紅蛋白，使肉及肉制品呈現良好的色澤[62]。Hammad等[63]通過將亞硝基血紅蛋白添加到碎牛肉中，發現與亞硝基血紅蛋白混合的牛肉樣品比與亞硝酸鹽和乳酸菌混合的樣品顏色更紅，這可能是由于形成了更多的亞硝基肌紅蛋白。

4.3 抗氧化劑

外源抗氧化劑不僅可以清除能與肌紅蛋白Fe2＋發生芬頓反應的過氧化氫，抑制肌紅蛋白氧化成MetMb；還可以通過抑制脂質過氧化，降低脂肪酸氧化產生的不飽和醛含量，從而間接維持肌紅蛋白中鐵離子處于還原狀態，減少肉色劣變[64]。多酚可作為自由基清除劑、鐵離子螯合劑以及MetMb還原劑用于肉制品護色[65]。Wei Peiyu等[66]將多酚處理后的羅非魚在－4 ℃條件下冷凍49 d，發現多酚處理減弱了珠蛋白的氫鍵斷裂并延遲了二硫鍵的形成，維持了冷凍期間珠蛋白結構的穩定，減少了血紅素輔基的暴露，抑制二價鐵離子的氧化。L-抗壞血酸作為肉制品加工過程中常用的護色劑和助色劑，可以有效抑制肉中脂肪氧化，降低自由基的產生。此外，還可以通過促進MetMb的還原穩定肉色[67]。研究發現，L-抗壞血酸會阻礙亞硝基與仲胺的結合，防止NO轉化為NO2，促使肉中粉紅色的亞硝基肌紅蛋白的產生，從而賦予肉制品鮮艷的顏色[68]。

5 微生物引起的肌紅蛋白結構變化及其對肉制品色澤的影響

微生物的繁殖是肉及肉制品在加工貯藏過程中肉色發生變化的又一重要因素。貯藏期間，需氧微生物的繁殖降低了肉表面的氧氣分壓，促進MetMb的形成[69]。此外，有些細菌會產生硫化氫，與肌紅蛋白結合生成硫代肌紅蛋白，使肉色發綠[70]。利用有益微生物發酵不僅可以獲得風味獨特、營養豐富、保質期長的發酵肉制品，而且部分含有亞硝酸鹽還原酶的微生物如乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌等，在發酵過程中還可以將NO3－轉化為NO，NO與肉中的肌紅蛋白結合生成亞硝基肌紅蛋白，從而達到維持肉色的目的[71-72]。此外，Huang Pan等通過在干香腸中接種凝固酶陰性葡萄球菌，發現該菌種具有一氧化氮合酶活力，可以催化L-精氨酸羥基化生成L-瓜氨酸和NO，NO可與肌紅蛋白結合形成顏色鮮紅的亞硝基肌紅蛋白，從而顯著提高干香腸的紅度值[73]。

6 結語

肉品經屠宰后充分放血，其肉色主要由肌紅蛋白血紅素輔基中心的卟啉鐵價位和血紅素輔基與珠蛋白的結合能力決定。在肉及肉制品加工貯藏過程中，很多因素均可能導致肌紅蛋白結構變化，從而影響肉色。隨著科技發展，新的加工貯藏技術層出不窮，探究肉中肌紅蛋白的結構性質以及功能特性對肉類行業意義重大，可以為保證肉制品的品質提供理論和技術支撐。