蛋白質定量質譜技術及其在食品加工用酵母中的應用

胡 娜，利佳煒，閆珍珍，陳 雄，李 欣*

（工業發酵省部共建協同創新中心，發酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業微生物重點實驗室，湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

蛋白質是生命體生理功能的主要參與者和執行者，是基因響應和環境變化之間溝通的橋梁[1]，因此研究蛋白質變化能直觀闡明生命體產生差異性狀的原因。對生物體開展高通量高精度的蛋白質水平分析，有利于探究環境或外源物質對蛋白質合成的影響，發現蛋白基因表達調控機制的關鍵位點[2]。早期所建立的蛋白質定性方法如化學測序法、酶聯免疫吸附劑試驗、蛋白質免疫印跡法以及雙向熒光差異電泳法等[3-5]已不能滿足新時代蛋白質研究的需求。隨著蛋白質序列數據庫的不斷完善，以定量為目的的檢測成為當下及未來的研究趨勢。

細胞蛋白質組檢測難度大，獲取酵母蛋白質組學所需的量化數據必須結合自動化技術和計算機技術。質譜法是結合這兩種技術實現高通量自動化表征蛋白質組的理想手段。其中液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術作為代表性技術之一，在研究蛋白質豐度跨度較大的酵母時，可分析鑒定出低豐度的蛋白質[6]。基于LC-MS/MS可將蛋白質組學研究分為兩類：“自上而下”蛋白質組學[7]和“自下而上”蛋白質組學[8]。“自上而下”蛋白質組學可直接完整獲取蛋白質序列信息，而“自下而上”蛋白質組學通過鑒別多肽來獲取蛋白質信息。相比較而言，“自下而上”蛋白質組定量技術不僅能在復雜體系中高效獲取蛋白質組信息，還能高通量的處理蛋白種類龐雜的樣品[9]。食品加工用酵母作為一類在基礎研究、食品釀造和工業發酵等領域被廣泛應用的真核微生物，其蛋白質組學研究一直受到相關研究人員的關注。在食品加工用酵母蛋白質組學中應用“自下而上”蛋白質組學技術適用性更廣。基于此，本綜述主要介紹近5 年“自下而上”蛋白質組定量技術及其應用于食品加工用酵母研究的最新進展。

1 “自下而上”蛋白質組定量技術

“自下而上”蛋白質組技術提出后經過不斷優化改進，逐漸適用于各個物種領域的研究，如植物、動物、微生物以及人體的各個組織或器官等[10-12]。在酵母這類微生物結構中，該技術由質譜定量分析蛋白質組降解的肽段推測所含蛋白質濃度為原理展開（圖1）。從技術流程的角度大致可分為標記定量（label quantification，LQ）法和無標記定量（label-free quantification，LFQ）法[13-14]兩大類。同位素標記作為分子領域最常見的技術手段之一，在定量蛋白質組學中也有適應性技術革新。同位素氨基酸標記細胞培養技術（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）通過細胞培養基中添加含13C標記的賴氨酸來開展研究。Sun Yu等[15]采用SILAC研究釀酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）BY4741菌株生長期間的蛋白質組變化，發現衰老細胞與熱量限制（calorie restriction，CR）細胞的蛋白質組之間顯著相關，從而進一步佐證了CR參與細胞衰老。然而單個同位素體內標記法鑒別蛋白質組的效率有限，并且限制了酵母細胞的培養條件，所以目前研究多采用對多肽中多種氨基酸基團進行體外同時標記。LFQ與同位素標記定量技術相比操作更簡便、價格更低廉、可對體態微小的生命體進行大規模蛋白質組定量研究。

圖1 “自下而上”測定酵母蛋白質組流程Fig.1 Flow chart of the “bottom-up” procedure for proteomic analysis of yeast

2 酵母蛋白質組定量技術研究進展

同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）標記法正逐漸成為常用的蛋白質同位素標記技術之一[16]。iTRAQ標記法采用4 種或8 種同位素標簽對多肽的氨基酸基團特異性標記，并可同時對多個樣品批量處理，針對酵母中相對分子質量高的蛋白質、極堿性蛋白質和極酸性蛋白質都有極高的檢出率[17]。此外，美國Thermo Scientific公司研發了一種新型多肽體外標記技術為串聯質譜標簽標記（tandem mass tag，TMT）技術[18]。迄今為止，TMT標記技術可同時運用16 種同位素對多肽的氨基基團進行特異性標記，以此增加鑒定位點從而提升蛋白質鑒定效率[19]。Gassaway等[20]通過TMT標記技術針對釀酒酵母蛋白質組開展的研究，測定發酵過程中11 個時間點的蛋白質和磷酸化位點的變化，辨析不同蛋白質復合體的結構、生長和代謝途徑的差異化表現。

LFQ要求蛋白質酶解產物進入質譜分析前需使用分餾技術使樣品充分分散，例如超濾輔助樣品制備（filter-aided sample preparation，FASP）[21]、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE）[22]、高pH值反相多肽分餾（high pH reversed-phase fractionation，HRP）[23]、超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）[24]等各種分離技術。蛋白分離技術結合質譜技術構成了酵母蛋白質組LFQ的完整方案。Zaman等[25]結合HRP分餾法分析添加過氧化氫和正常情況下酵母發酵過程中蛋白質組差異，并提出該流程可適用于檢測植物的蛋白質組從而推進植物代謝工程的研究進展。

近5 年來，運用同位素標記定量技術鑒定酵母蛋白質組的相關研究如表1所示。以釀酒酵母為研究對象的LFQ蛋白質組檢測方案如表2所示。

表1 同位素標記定量法測定酵母蛋白質組技術方法Table 1 Isotope labeling methods for quantitative determination of yeast proteins

表2 LFQ測定釀酒酵母蛋白質組技術方法Table 2 Label-free labeling methods for the quantitative determination of yeast proteins

蛋白質組定量技術是以質譜為理論依據開發的創新方法，而質譜對蛋白質測定的精準度受到以下因素的影響：1）提取方案的差異；2）檢測對象的差異；3）結果信息分析手段的差異。因此，酵母蛋白質組定量技術的優化需從這3 個影響因素著手。酵母蛋白質組測定過程中的關鍵技術點在于：蛋白質組提取技術、蛋白質組鑒定技術、生物學信息分析技術（圖2）。

圖2 酵母蛋白質組分析技術路線圖Fig.2 Technical roadmap for yeast proteomic analysis

2.1 蛋白質組提取技術

針對酵母蛋白質組定量技術而言，細胞蛋白質有效溶出率是首要關注重點[32]。然而，大多數酵母的細胞壁較厚，難以使胞內蛋白質全部溶出。目前胞內酵母蛋白的釋放多采用物理破裂方法，如超聲波細胞裂解法和珠磨振蕩研磨法等。MP Biomedicals公司建立的FastPrep Lysis Matrix C beads技術[33]就是通過優化研磨珠材質進而提升提取效率。然而，超聲波細胞裂解法和珠磨振蕩研磨法提取過程中產生的熱量會造成蛋白質損失。因此，為確保高效破裂細胞的同時且無蛋白質損耗，在低溫條件（通常為4 ℃）下采用溫和提取液進行短時高效的細胞破壁處理可能是最優提取方法。

蛋白質提取最常見的方法是采用高濃度尿素（8 mol/L尿素＋碳酸氫銨或Tris-HCl）來提高蛋白質溶解度[23]。然而，高濃度尿素也會帶來不利的影響，如導致后續添加的蛋白酶變性并且需要增加脫鹽處理的步驟，而脫鹽處理不可避免地會對蛋白質造成損失。為優化提取方案，Almeida等[34]對多種提取液進行對比，發現大多數提取溶液配制復雜且均需要加入蛋白酶抑制劑，而美國Sigma-Aldrich公司的CelLytic Y試劑[35]在無需加入蛋白酶抑制劑的同時，不僅可以高效裂解酵母細胞還可以避免蛋白質損失。現有多家國際生物檢測公司推出更便捷的試劑，如美國Thermo Scientific公司的Y-PER?酵母蛋白提取試劑[36]中含有機緩沖劑、溫和的非離子洗滌劑以及各種鹽溶液；美國Sigma-Aldrich公司ProteoPrep?總蛋白提取試劑盒[37]中所含成分為4 種提取劑、碘乙酰胺和三丁基膦溶液；生工生物工程（上海）股份有限公司的一步法酵母活性蛋白提取試劑盒[38]的組成成分為提取試劑、蛋白酶抑制劑、DTT以及PMSF；美國Invent生物技術公司的Minute?酵母、細菌和微藻等厚胞壁微生物總蛋白提取試劑盒[39]含有變性緩沖液、天然緩沖液和蛋白提取粉。上述公司研發的試劑盒均采用多種溫和裂解液復合而成，在防止酵母蛋白質變性的同時，可盡可能地縮短提取時間，以獲取酵母胞內完整的蛋白質組。

2.2 蛋白質組鑒定技術

LC-MS/MS技術是量化蛋白質組濃度的有效手段，主要是通過最大化提取蛋白質序列信息，進而與數據庫進行有效比對分析。LC-MS/MS中液相系統的主要目的是最大化分散樣品并充分提高質譜儀的利用率。研究表明美國Thermo Scientific公司的新型Vanquish Neo UHPLC[40]系統可縮短樣品進樣時間，增加蛋白質檢測的覆蓋率。LC-MS/MS中起關鍵作用的是質譜系統，主要透過一級相對分子質量分析推斷出發生何種翻譯后的修飾，再測定二級碎片離子的相對分子質量推斷出翻譯后修飾發生的位點[41-42]。依據MS1或MS2的信號強度鑒別多肽序列從而定位對應的蛋白質，以此達到定性、定量分析蛋白質組的目的。

為進一步提升質譜儀的性能，不同特點的質譜儀聯用是一條可行的策略，包括能準確鑒別同位素標記位點的四極桿-飛行時間（quadrupole-time of fligh，Q-TOF）質譜儀、能對肽段精準定性的靜電場軌道阱以及能提升多肽鑒定覆蓋率的線性離子阱（linear ion trap，LIT）等進行多種質譜儀聯用模式[23,43]。張偉等[44]利用四極桿、靜電場軌道阱和線性離子阱三合一質譜系統檢測酵母中蛋白質組，在假陽性率q＜0.01的情況下圖譜的有效梯度解析率可達到42.1%。隨著質譜儀性能不斷優化，蛋白質定量效果有顯著的提升。周岳等[45]以最新的Orbitrap Exploris 480質譜儀配備電動離子漏斗進一步提高質譜靈敏度。離子傳輸組件則采用最新的雙彎曲四極桿以提高抗污染能力，同時兼容高場非對稱波形離子遷移譜（high-field asymmetric wave formion mobility spectrometry，FAIMS）技術。此設備可提高對蛋白質組分析的靈敏度和穩定性，進一步優化數據依賴采集（data dependent acquisition，DDA）、數據獨立采集（data independent acquisition，DIA）以及TMT標記法的關鍵質譜參數。無論是辨認同位素標記點還是鑒定蛋白質或肽段都需要盡可能提高質譜的靈敏度、分辨率及可重復性。Johnson等[46]研究表明傅里葉變換離子回旋共振質譜儀（fourier-transform ion-cyclotron resonance mass spectrometry，FT-ICR-MS）在m/z400時可提供約為200 000的分辨能力，能發現在其他類型的質譜儀中被遺漏的同位素峰簇并能直接確定蛋白質翻譯后的修飾位點。交聯質譜技術（cross-linking mass spectrometry，XL-MS）以非特異光化學反應為基礎，能高效鑒別蛋白質復合物結構[47]。Gutierrez等[48]驗證了XL-MS在大型蛋白質復合物中使用光交叉連接鑒定的可行性，并且開發了以琥珀酰二嗪亞砜為基礎的新型質譜交聯劑，以便質譜快速準確地鑒定光交叉連接的位置。然而，這些新技術在酵母蛋白質研究中的應用還不夠普遍，其可行性仍有待驗證。常見定量質譜儀的優劣對比如表3所示。

表3 各類質譜技術的對比Table 3 Comparison of various mass spectrometry techniques

2.3 生物信息分析技術

生物信息技術包括對完整蛋白質及多肽的質譜數據預處理、數據庫搜索鑒定以及翻譯修飾后的位點定位等幾個方面[49]，其中的關鍵核心是對質譜中得到的數據結果進行有效解析。隨著數據庫的不斷完善，質譜獲取的生物信息通過數據庫進行對比從而預測結果是最常用的定性方法，一般與基因本體（gene ontology，GO）、蛋白質直系同源簇（cluster of orthologous groups of proteins，COG）、京都基因和基因組（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、蛋白質家族（protein families，Pfam）、亞細胞定位（subcellular localization）[50-51]等數據庫進行聯用。但是這些理論序列并不能直接精準鑒別所有酵母中的蛋白質序列，需對其做出兩方面改進。其一，從分析軟件著手，改變質譜結果掃描策略；其二，從數據庫著手，開發針對性酵母蛋白質數據庫。

常見的質譜儀DDA掃描模式可完整掃描出一般化合物相對分子質量的生物學信息，但對于肽段離子的掃描存在限制性和隨機性，會導致生物信息的缺失率增高。現多采用的DIA掃描技術將質譜的整個全掃描范圍分為若干個窗口，高速、循環地對每個窗口中的所有離子進行選擇、碎裂、檢測，以此彌補DDA掃描模式造成的生物信息缺失，從而進一步提升數據利用率[52]。在復雜的酵母樣品體系中，DIA掃描模式是通過二級質譜信號進行定量，減少了在一級質譜信號中存在的相似質荷比離子的干擾。Santos等[53]提出兩者結合的混合數據采集（mixed-data acquisition，MDA）技術有利于克服無標簽定量法常見瓶頸的問題，即m/z值無法區分。選用MDA技術提升酵母蛋白質組分析的效率可能成為當下及未來的一種新趨勢。如今，改善多級質譜掃描策略可增進蛋白質定量統計方法的有效率。通常蛋白質結果分析選用Protein Pilot軟件[54]，其主要針對特異性肽鏈的序列分析鑒定。Tian Xiaobo等[55]在一級質譜中利用DIA掃描模式對含LysC的酵母蛋白質進行分析，并利用乙酰-異亮氨酸-脯氨酸標簽（acetyl-isoleucine-proline，Ac-IP）進行三重標記蛋白質定量分析。為增加蛋白質結果可信度，來自瑞典研究所的Zhu Yafeng等[56]提出了一種專為質譜數據中的差異蛋白表達分析而開發的定量統計分析策略DEqMS。通常方差評估著重依賴于肽段量化的數量，而增加了單肽鑒定方案的DEqMS能更準確地評估蛋白質方差估計的數據依賴性。以上研究是基于提升特殊肽段離子鑒定蛋白質的效率為目標而進行的創新，為完善生物信息分析完整度還需建立更具針對性的蛋白質序列數據庫。一些研究人員已開始嘗試建立單一酵母針對性蛋白質組序列數據庫，如Picotti等[57]建立了一種由釀酒酵母多肽序列生成的數據庫，可用于精確分析釀酒酵母蛋白質的數量性狀位點（quantitative trait loci，QTL），由此構建了一套完整的釀酒酵母蛋白質組學分析方法。Rathod等[58]開發并建立了第一個酵母磷酸肌苷結合蛋白（yeast phosphoinositide-binding proteins，YPIBP）數據庫，主要用于多種酵母磷酸化蛋白質組的鑒定。

3 蛋白質組定量技術在食品加工用酵母研究中的應用前景

酵母被廣泛應用于酒、調味品、乳品、酵素、面包等食品發酵和食品釀造過程中。酵母蛋白質組定量技術有助于分析工業發酵和食品釀造中酵母蛋白質變化，以及不同應用條件下酵母蛋白質的響應特征，從而闡明酵母代謝特征和調控機制，開發出更有應用優勢的酵母菌株并實現加工工藝的優化和產品品質的提升。近5 年研究人員對食品加工用酵母蛋白質組的研究如表4所示。

表4 近5 年食品加工用酵母蛋白質組的研究Table 4 Proteomic studies on yeasts used for food processing in the past five years

3.1 探究蛋白質合成機制

為提升酒、乳品和酵素等食品的產量進行酵母功能性改造不失為一種選擇。Negoro等[68]采用定量蛋白質組學技術對高產蘋果酸的菌株進行蛋白質差異化解析，發現高產蘋果酸的關鍵因素與清酒中內含葡萄糖誘導降解缺陷（glucose-induced degradation deficient，GID）蛋白編碼基因（GID1-GID9）有關，其中GID1、GID2、GID3、GID4、GID5、GID8和GID9表達的產物均可使釀酒酵母產出的蘋果酸含量提升。本團隊對魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）進行基因組測序，以此尋找蛋白質編碼基因序列的信息[69]。Li Zhen等[70]對含核糖體蛋白rP59的菌體定量解析多種蛋白質的基因表達位點，由此提出核糖體組裝與蛋白基因表達調控的耦合模型。通過蛋白質組定量技術可研究mRNA的轉錄、加工和翻譯期間的不同影響機制。酵母中還含有多處mRNA-蛋白質調控位點[71]，進而增加了mRNA合成蛋白質過程的可變性。這個過程的關鍵點在于mRNA合成蛋白時會先產生一段特殊的肽鏈序列——信號肽，其可引導新生蛋白穿過內質網膜進行分泌。蛋白質定量技術提供了蛋白質序列的精確信息，可為找尋特殊的信號肽序列提供可能性。華東理工大學的Zhu Jinxiang等[72]根據畢赤酵母整個蛋白質的鑒定結果，檢驗出a信號肽密碼子對畢赤酵母所攜帶蛋白質的分泌效率產生影響，從而設計出更合理的a信號肽密碼子以此改進畢赤酵母的基因序列。

3.2 探究蛋白質修飾及應用

真核微生物的蛋白質成熟需經過加工處理，即翻譯后的修飾過程，該過程與調控生命進程的變化息息相關。蛋白質在修飾過程中會發生磷酸化、泛素化、甲基化、糖基化、脂基化或乙酰化等[73-74]變化。參與酵母的生長發育、信號傳導以及病變發生發展的許多蛋白質都需要以不同的方式進行翻譯后修飾。定量蛋白質組分析技術為揭示蛋白質翻譯后修飾的基本規律和明確蛋白質的修飾進程提供了強有力的技術支持。酵母細胞對于合成基酒和天然基酒中高分子質量多糖和低聚糖的差異性化起作用[75]。袁鐵錚[76]則通過LFQ蛋白質組技術法分析不同碳源培養條件下的樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）磷酸化蛋白質組變化情況，結果顯示葡萄糖培養下酵母細胞內存在351 種磷酸化蛋白質，而木糖會明顯增加其中45 種磷酸化修飾蛋白的豐度。代謝途徑匯聚分析則表明糖酵解（embden-meyerhof-parnas pathway，EMP）、三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）和戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PPP）中的部分關鍵酶的磷酸化修飾都受到碳源的影響。Matsuki等[77]研究釀酒酵母細胞的內質網應激與未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）途徑時，發現在該時期添加衣霉素可提升內質網上的核糖體蛋白uS10、uS3和eS7的泛素化水平。

3.3 探究環境脅迫及調控機制

食品發酵過程中為達到產品工業化生產，往往會導致發酵環境不利于酵母的生長。在高濃度環境下酵母蛋白質組學會產生明顯變化，研究酵母高產性菌株可從蛋白質組學的角度進行分析。蛋白質組的濃度變化與酵母生長調控路徑有密切聯系。在發酵過程中酵母細胞會伴隨發生一系列環境脅迫，如在工業發酵和食品釀造的過程中常常會受到高溫、高糖、高含量的有機酸或乙醇等物質的干擾。環境脅迫不僅會使酵母生長進程發生改變，還會同步影響酵母蛋白質組濃度。研究發現酵母蛋白質組定量技術結合生物信息學能夠預測在酵母生長、物質跨膜運輸、中間代謝或呼吸過程中起決定性作用的蛋白質數量以及其作用效果。由此結果建立在不同應激反應條件下的早期和晚期細胞生物學模型，有助于完整闡釋逆境與蛋白質的關系[78]。此外，探究酵母在多種不利環境條件的蛋白質組變化，有助于建立更優質的食品發酵體系。袁鐵錚[76]利用LFQ蛋白質組技術在培養條件分別為木糖和葡萄糖的畢赤酵母中共鑒定出4 085 種蛋白質，表達上調的蛋白質分別有1 551 種和789 種。進一步發現在木糖培養條件下，PPP和脂肪酸代謝途徑的差異蛋白質大部分上調。本團隊針對源于醬油發酵中的魯氏接合酵母在熱激下的響應條件進行探索[79]，對其蛋白質組結果進行預判，基于文獻提出合理性假設并將驗證其可行性。在食品發酵的過程中，酵母也可能因為外源物質中殘留的有害物質影響其蛋白質的特異性表達。Liu Shuai等[80]通過無標記蛋白質組定量技術研究加入青蛤凝集素孵育24 h后釀酒酵母蛋白表達譜的變化，分析在發酵過程中刺激機制的具體影響及原因。

3.4 探究細胞器的響應機制

細胞器在酵母生長過程中都起到重要作用，蛋白質組在細胞器的分布情況決定其不同效應的響應。在酵母細胞器中，核糖體是蛋白質合成的場所，線粒體是為細胞生長提供能量的場所，各個細胞器上的膜是體內傳遞信息的必經通道。蛋白質組學的結果不僅能反映外源脅迫時酵母生長路徑的變化，還能更精細反映在受到外界脅迫時不同細胞器產生的響應機制。核糖體蛋白、線粒體蛋白、膜蛋白等都對酵母的生長發育產生影響，因此Azizi等[30]采用新型S-BPS鑒定出釀酒酵母的3 043 種蛋白，能更全面地檢出膜蛋白、線粒體蛋白和核糖體蛋白，為后續探究在不同逆境下細胞器蛋白的變化提供可行性實驗基礎。Giardina等[81]以iTRAQ標記質譜技術對釀酒酵母進行蛋白質組學分析，表明糖酵解酶、糖異生酶和線粒體蛋白的下調會導致糖酵解、糖異生和線粒體功能的變化。酵母蛋白質組不僅會對體內的細胞器發生響應性變化，一些研究人員還發現酵母為適應匱乏的生長條件會利用細胞外囊泡（extracellular vesicles，Evs）進行細胞之間的蛋白質運輸。Winters等[82]對釀酒酵母蛋白質組學進行分析，在低葡萄糖條件下生長的酵母細胞中鑒定了377 種與細胞內囊泡簇（intracellular vesicle clusters，IVC）相關蛋白質，表明在低碳源的情況下Evs可作為蛋白質的運輸載體。

3.5 探究發酵食品的風味形成

酵母與發酵食品風味形成緊密相關，研究酵母蛋白質組學可探究發酵食品風味形成機制。葡萄酒釀造過程有上百種酵母共同作用，不同配比均會使葡萄酒產生不同的香氣和風味。García-Ríos等[83]對庫德里阿茲威酵母（S.kudriavzevii）、葡萄汁酵母（S.uvarum）和釀酒酵母進行蛋白質組學分析，發現在低溫釀造葡萄酒時這三種酵母能更好地維持產品的風味。啤酒釀造工藝中的蛋白質組學源自于小麥和酵母的200多種獨特蛋白質[84]。研究發現不同風味的酒類發酵與酵母蛋白質組學密切相關，因此可以通過研究酵母的蛋白質組學進而優化啤酒釀造工藝。Kerr等[85]探究市售啤酒中蛋白質差異與風味之間的關系，通過蛋白質組定量技術發現啤酒發酵中1 418 種特異性蛋白質影響成品啤酒的口感和風味。蛋白質組學還能夠用于識別和測量糖蛋白及其特異性修飾位點。酵母細胞在起泡酒的釀造過程中發生的自溶會對起泡酒的感官質量產生影響。Porras-Agüera等[86]對起泡酒進行第二次的密封發酵及其陳釀期的釀酒酵母蛋白質組學進行研究，發現其在CO2超壓條件下參與甘油合成的相關蛋白質含量增加，但參與活性氧、乙醇、乙醛和乙酸等代謝物反應過程中的蛋白質含量降低。

3.6 探究肉類替代品的制造

隨著技術的發展和對環境的保護，人造蛋白制品的應用不斷增加。Humpen?der等[87]提出發酵微生物獲得蛋白可替代全球牛肉消耗的20%。其中最受關注的“人造肉”研制成為熱點。酵母蛋白作為一種新型的微生物蛋白資源，具有較好的加工性能，可規避豆類蛋白自身的豆腥味、過敏源及其限制性氨基酸缺乏等問題。Duppala等[88]對可運用在新型“人造肉”漢堡中的畢赤酵母進行蛋白質組學分析，發現畢赤酵母是一種可以生產大量異源蛋白質且自身含大量蛋白的優良“人造肉”基礎原料。為增加素肉的觀感，通常利用酵母生產血紅蛋白使產品富有紅褐色的質地。Reyes等[89]利用畢赤酵母為大豆植物肉提供血紅蛋白及其他蛋白質，經過“自下而上”蛋白質組學分析發現該制品對人體無慢性致敏性和毒性風險。研究人員利用酵母基因編輯技術使重組血紅蛋白基因在酵母中高效表達。Ishchuk等[90]通過對釀酒酵母進行ROX1、HMX1、VPS10和AHSP基因的組合改造，進一步測定改造菌株的蛋白質組從而優化酵母血紅素密碼子，使其高產血紅蛋白，并可防止血紅蛋白的降解。酵母蛋白質對植物肉質替代品的優化改良起到了有效作用，對其酵母蛋白質組進行測定，可實現對“人造肉”成分更加精準的把控。

4 結語

蛋白質組學以揭示生命體的整個活動規律為目的，主要用于闡明生命體蛋白質的表達模式以及功能作用。近5 年來隨著研究的不斷深入，酵母蛋白質組學不僅涉及定性分析，還進一步拓展至精確的定量分析。蛋白質組研究結果也呈現出由靜態描述轉變為動態描述的趨勢。這為蛋白質組測定提出了更高要求，如高效低損耗的提取純化技術、快速的分離技術、高精度多維度的質譜定量技術和全面的特定數據庫等。蛋白質組學計量技術的進步也必將推動人們對酵母生理響應機制、逆境耐受機理和微生物互作關系的理解，可助力于優良食品加工用酵母的選育、食品發酵工藝的優化、發酵食品品質的提升、酵母合成生物學工作的開展等。