三明治型魔芋葡聚糖/海藻酸鈉/魔芋葡聚糖復合保鮮涂膜對三文魚魚片蛋白氧化的影響

宋 穎，王雅妮,2，楊峻乙，喬 羽，李秋瑩，李穎暢，楊 旭，勵建榮，孫 彤,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 錦州 121013；2.遼寧安井食品有限公司，遼寧 鞍山 361003；3.民澤龍羊峽生態水殖有限公司，青海 海南藏族自治州 811800）

水產品指魚、蝦、蟹、貝類、藻類等鮮活產品以及經冷凍、熟制、腌制和綜合利用的加工制品[1]，水產品富含蛋白質、氨基酸、維生素、無機鹽等多種營養物質。但其水分含量高，組織柔軟，易滋生微生物，內源性蛋白酶活躍。同時，水產品中不飽和脂肪酸極易被氧化，生成醛、酮、羧酸等物質，產生不良氣味，并出現黏度增加、口感下降的現象，最終導致水產品腐敗變質，營養價值和商品價值降低[2]。水產品保鮮技術針對引起水產品腐敗變質的因素采取一系列干預，達到延長貨架期、增加食用價值、減少經濟損失的目的。

常用的水產品保鮮技術包括物理保鮮、化學保鮮及生物保鮮等[3]。而將多種保鮮技術復合使用，可使其優勢互補，協同增效，是水產品保鮮技術的主要發展方向。其中，蔡路昀等[4]研究發現超高壓結合姜酚處理后的海鱸魚魚肉的品質優于單一處理組和未處理組，表明復合處理具有一定協同保鮮效應，使保鮮效果更優；謝晶等[5]采用復合生物保鮮劑涂膜結合氣調包裝貯藏帶魚，研究結果表明，復合生物保鮮劑對帶魚有良好的抗菌保鮮作用，與氣調包裝結合使用后，其保鮮效果更優。涂膜保鮮通過噴涂、鋪展和浸漬等方法將保鮮劑涂覆于食品或包裝材料表面，可抑制食品氧化，同時提高食品的耐菌、耐機械損傷能力，最大限度地保持食品品質，延長貨架期[6]。有研究表明，單一成膜基質涂膜的機械阻隔性能及抗菌、抗氧化性能較差，對食品的保鮮性能有限，應用和推廣受到了限制[7]。因此，保鮮涂膜的改性研究具有十分重要的意義。目前，利用生物保鮮技術改善涂膜的機械性能及抗菌、抗氧化性能已成為國內外的研究熱點[8]。

魔芋葡聚糖（konjac glucan，KGM）和海藻酸鈉（sodium alginate，SA）都是安全無毒、成本較低的天然高分子成膜材料，可作為食品保鮮涂膜的主體材料[9]。百里香酚（thymol，Thy）又稱麝香草酚，是一種天然的抑菌劑，可導致病原菌細胞膜損傷，從而達到抗菌和延長食品貨架期的目的[10-11]。ε-聚賴氨酸鹽酸鹽（ε-poly-Llysine hydrochloride，ε-PL）是GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中允許使用的食品添加劑，具有抗菌性，在食品保鮮領域應用廣泛[12-13]。基于此，本實驗以KGM和SA為成膜基質，以Thy和ε-PL為保鮮劑，制備三明治型復合保鮮涂膜，并研究涂膜對三文魚魚片蛋白氧化的影響，為可食性涂膜在三文魚魚片貯藏保鮮中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三文魚（（5.00±0.50）kg/條）購于遼寧省錦州市某海水養殖場。

KGM（食品級） 昭通市三艾有機魔芋發展有限公司；SA（分析純） 深圳市益百順科技有限公司；Thy（生物技術級別） 上海麥克林生化科技有限公司；ε-PL（食品級） 浙江新銀象生物工程有限公司；超微量Ca2＋-ATPase測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒 上海吉至生化科技有限公司；蛋白質羰基試劑盒 北京盒子生工科技有限公司；其他試劑均為分析純；去離子水（電導率＜15 μS/cm）為實驗室自制。

1.2 儀器與設備

MS-105DU電子分析天平 瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；DF-II型集熱式磁力加熱攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；MLS-3030CH立式高壓滅菌鍋 三洋電機（廣州）有限公司；FE20 pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FSH-2A高速均質機 常州越新儀器制造有限公司；UV-2250紫外-可見光光度計 尤尼柯儀器有限公司；HHS21-4數顯雙列四孔水浴鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；Legend Micro21R臺式微量離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；970 CRT熒光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Scimitar 2000傅里葉變換紅外光譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 涂膜液的制備

分別取一定量的KGM和SA溶于去離子水中，并加入終體積分數0.3%的丙三醇，在45 ℃條件下磁力攪拌1 h，制備0.5 g/100 mL的KGM和1.0 g/100 mL的SA涂膜液。在SA涂膜液中分別按照0.09、0.18 g/100 mL加入ε-PL，制備SA＋ε-PL涂膜液；在KGM涂膜液中按照2 g/100 mL加入Thy，制備KGM＋Thy涂膜液；在SA涂膜液中按照4 g/100 mL加入Thy，制備SA＋Thy涂膜液。

1.3.2 三文魚魚片涂膜處理

將三文魚置于消毒后的實驗臺上用冰猝死，去頭、皮及內臟后取魚體兩側背脊魚肉，每片（250±5）g。將魚片置于無菌操作臺中，用無菌水清洗后無菌吸水紙擦干其表面水分進行涂膜處理。將魚片在KGM涂膜液中浸漬1 min，覆蓋第1層涂膜液；然后于SA涂膜液中浸漬1 min，覆蓋第2層涂膜液；最后將魚片完全浸漬于KGM涂膜液中后立即取出，即為三明治型KGM/SA/KGM涂膜處理的樣品。將上述第2層涂膜液分別換成SA＋ε-PL（0.18 g/100 mLε-PL）、SA＋Thy涂膜液，即為三明治型KGM/SA＋ε-PL/KGM和KGM/SA＋Thy/KGM涂膜液處理的樣品；將上述第2層涂膜液換成SA＋ε-PL（0.09 g/100 mLε-PL）涂膜液，第3層涂膜液換成KGM＋Thy涂膜液，即為三明治型KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy涂膜處理的樣品。用無菌水替代涂膜液處理的魚片為空白組樣品。將各組魚片表面的膜液自然風干，裝入滅菌后的蒸煮袋中，密封后放入4 ℃冰箱中貯藏。課題組前期研究表明貯藏第12天時三文魚已腐敗[14]，故在貯藏第0、3、6、9、12天測定相關蛋白氧化指標。

1.3.3 三文魚魚片肌原纖維蛋白的提取與測定

1.3.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參照ZhaoXue等[15]的方法稍作修改。取一定量的魚肉，絞碎后稱取5.00 g于離心管中，按料液比1∶4（m/V）加入Tris-HCl溶液（20 mmol/L、pH 7.2），勻漿后于4 ℃、5 000 r/min離心20 min，取沉淀按上述步驟重復提取2 次。將最終所得沉淀按料液比1∶3（m/V）加入至含0.6 mol/L NaCl的Tris-HCl溶液（20 mmol/L、pH 7.2），混合均勻后，置于4 ℃下充分提取1 h，然后4 ℃、5 000 r/min離心20 min，取上清液即為肌原纖維蛋白溶液，采用雙縮脲法[16]測定肌原纖維蛋白質量濃度，然后用含0.6 mol/L NaCl的Tris-HCl溶液（20 mmol/L、pH 7.2）將肌原纖維蛋白質量濃度調至5 mg/mL備用。

1.3.3.2 總巰基和活性巰基含量的測定

參照Xu Yanshun等[17]的方法稍作修改。采用5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）測定肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的含量。取1.00 mL 5 mg/mL肌原纖維蛋白溶液和9.00 mL 50 mmol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L KCl、10 mmol/L 乙二胺四乙酸、8 mol/L尿素）充分混勻。取5 mL上述混合溶液加入0.50 mL DTNB，于25 ℃反應25 min，測定412 nm波長處吸光度，代入標準曲線方程計算總巰基含量，結果以蛋白質量計，單位為nmol/mg。類似地，上述操作中磷酸鹽緩沖液不加尿素，將混合液于4 ℃反應60 min，測定412 nm波長處吸光度，按上述方法計算活性巰基的含量，結果以蛋白質量計，單位為nmol/mg。

1.3.3.3 表面疏水性的測定

參照Chelh等[18]的方法稍作修改。取1.00 mL 5 mg/mL肌原纖維蛋白溶液于90 ℃水浴30 min，然后室溫冷卻10 min。然后加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍溶液，混勻后室溫反應10 min，于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液，測定595 nm波長處的吸光度A，以不含肌原纖維蛋白的磷酸緩沖溶液作為對照，并按相同方法測定其595 nm波長處的吸光度A0。表面疏水性以溴酚藍結合量（下式）表示。

1.3.3.4 溶解度的測定

參照Riebroy等[19]的方法稍作修改。取1.00 g魚肉，加入19.0 mL 20 mmol/L、pH 7.2 Tris-HCl緩沖溶液（含0.6 mol/L NaCl）均質勻漿，于4 ℃、6 000 r/min離心15 min，采用雙縮脲法[16]測定上清液蛋白質含量，單位為mg/g。

1.3.3.5 羰基含量的測定

取5 mg/mL肌原纖維蛋白溶液，采用蛋白質羰基試劑盒測定羰基含量，結果以蛋白質量計，單位為nmol/mg。

1.3.3.6 Ca2＋-ATPase活力的測定

取5 mg/mL 肌原纖維蛋白溶液，參照超微量Ca2＋-ATPase測定試劑盒說明書進行測定。以1 h內1 mg組織蛋白催化ATP分解產生1 μmol無機磷為1 個酶活力單位，單位為U/mg。

1.3.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

取適量貯藏第0、6、12天的肌原纖維蛋白樣品，冷凍干燥后與溴化鉀混合，研磨后進行壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀測定其透光率曲線，采用Omnic軟件和PeakFit 4軟件處理數據，分析肌原纖維二級結構相對含量變化。

1.3.3.8 熒光光譜分析

取貯藏第0、12天的5 mg/mL肌原纖維蛋白溶液，參照Moradi等[20]的方法，采用熒光分光光度計測定肌原纖維蛋白內源熒光、同步熒光、三維熒光光譜，分析蛋白質三級結構變化。

1.4 數據處理與分析

上述實驗均進行3 次平行測定，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 復合涂膜對三文魚肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的影響

巰基對維持肌原纖維蛋白空間結構穩定性具有重要意義。蛋白質中巰基由活性巰基和蛋白質內部隱藏巰基兩部分組成[21]。如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，各組魚片的總巰基和活性巰基含量均明顯下降，其中空白組下降幅度最大，經復合涂膜處理魚片的總巰基和活性巰基含量下降較緩慢，說明復合涂膜處理有助于延緩蛋白質的氧化。經KGM/SA＋ε-PL/KGM涂膜處理后，魚片的總巰基和活性巰基含量略高于空白組，這可能是由于ε-PL具有抗菌性[22]，抑制了三文魚貯藏過程中微生物的生長，進而減緩了蛋白氧化，使魚片的總巰基和活性巰基含量下降減緩。經KGM/SA＋Thy/KGM和KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy復合涂膜處理后，魚片的總巰基和活性巰基含量下降明顯減緩，且在貯藏后期，KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy復合涂膜處理的效果更優。這可能是由于Thy可以吸附在巰基上，與巰基競爭捕獲自由基，進而抑制巰基被氧化[23]，且ε-PL具有抗菌性[12-13]，ε-PL和Thy產生了協同增效作用，抑制了巰基氧化，延緩總巰基和活性巰基含量的下降，從而較好地維持三文魚魚片的品質。

圖1 魚片貯藏過程中肌原纖維蛋白總巰基（A）和活性巰基（B）含量的變化Fig.1 Changes in total sulfhydryl (A) and active sulfhydryl (B) of MP contents in fillets during storage

2.2 復合涂膜對三文魚魚片肌原纖維蛋白表面疏水性、溶解度、羰基含量和Ca2＋-ATPase活力的影響

蛋白質表面疏水性在一定程度上反映了蛋白質的變性程度，可根據溴酚藍結合量表征蛋白表面疏水性[24]，進而衡量蛋白質的變性程度。如圖2A所示，隨著貯藏時間的延長，各組魚片的蛋白表面疏水性均明顯上升，其中空白組上升幅度最大，且與KGM/SA＋ε-PL/KGM復合涂膜處理組的表面疏水性變化無明顯差異，經KGM/SA＋Thy/KGM和KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy復合涂膜處理魚片的表面疏水性增長緩慢，說明ε-PL作為抗菌劑雖然延緩了魚片肌原纖維蛋白的氧化，但對蛋白質表面疏水性幾乎沒有影響[25]，添加Thy的復合涂膜使魚片蛋白表面疏水性的增長速度減緩，說明Thy和ε-PL復合后，涂膜的抗菌、抗氧化性能增強，延緩了蛋白質內部疏水基團的暴露和蛋白氧化。

蛋白質溶解度的降低緣于蛋白質氧化變性、交聯和聚集。因此，蛋白質溶解度越低，其蛋白氧化程度越高[26-28]。如圖2B所示，隨著貯藏時間的延長，各組魚片的蛋白質溶解度均明顯下降，其中空白組下降幅度最大，經復合涂膜處理魚片的蛋白質溶解度下降緩慢，說明ε-PL和Thy可以有效地抑制微生物的生長繁殖和內源酶活性，充分發揮其抗菌、抗氧化活性[25,29]，從而延緩了三文魚魚片肌原纖維蛋白的變性。KGM/SA＋ε-PL/KGM涂膜處理組在貯藏前期略高于空白組，在后期與空白組無明顯差異。KGM/SA＋Thy/KGM和KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy處理組的蛋白質溶解度在前期無明顯差異，說明添加2 g/100 mL和4 g/100 mL Thy對蛋白質溶解度無明顯影響。在貯藏后期，KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy處理組的蛋白質溶解度略高于KGM/SA＋Thy/KGM處理組，這可能是由于ε-PL具有抗菌性[14]，使KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy處理三文魚魚片菌落總數低于KGM/SA＋Thy/KGM處理組，所以蛋白質溶解度下降緩慢。

圖2 貯藏過程中魚片肌原纖維蛋白表面疏水性（A）、蛋白溶解度（B）、羰基含量（C）和Ca2＋-ATPase活力（D）的變化Fig.2 Changes in surface hydrophobicity (A),protein solubility (B),carbonyl content (C) and Ca2+-ATPase activity (D) of MP in flilets during storage

氨基酸側鏈被活性氧氧化后生成羰基衍生物，因此羰基含量被認為是蛋白質氧化的重要指標之一[30]。如圖2C所示，隨著貯藏時間的延長，各組魚片的蛋白質羰基含量均明顯上升，其中空白組上升幅度最大，其他處理組上升較為緩慢，這可能是由于涂膜在一定程度上阻隔了氧氣的進入，延緩了三文魚肌原纖維蛋白的氧化。KGM/SA＋ε-PL/KGM涂膜處理組在前期與空白組無明顯差異，在后期明顯高于空白組，與KGM/SA＋Thy/KGM復合涂膜處理組相比，KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy復合涂膜處理的效果更優。這是由于Thy有較強的自由基清除活性[31]，與ε-PL發揮協同增效作用，延緩了蛋白質的氧化，減緩了羰基含量的上升。

Ca2＋-ATPase活力取決于肌球蛋白的變性程度，可用來反映肌球蛋白的變性程度，可作為判斷蛋白氧化的重要指標[32]。如圖2D所示，隨著貯藏時間的延長，各組魚片的蛋白質Ca2＋-ATPase活力均逐漸下降，其中空白組下降幅度最大，經復合涂膜處理魚片的蛋白質羰基含量上升較為緩慢。經KGM/SA＋ε-PL/KGM涂膜處理后，魚片的Ca2＋-ATPase活力與空白組差異不大。當加入Thy后，KGM/SA＋Thy/KGM和KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy復合涂膜處理組的蛋白質Ca2+-ATPase活力下降速率明顯降低，且KGM/SA+ε-PL/KGM+Thy復合涂膜處理組略高于KGM/SA+Thy/KGM復合涂膜處理組，這是由于涂膜可以隔絕外界氧氣，且ε-PL與Thy產生了協同增效作用。Ca2+-ATPase活力的變化與巰基含量的變化一致。

2.3 三文魚魚片肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜分析結果

蛋白質中酰胺I帶在1 700～1 600 cm－1處有特征吸收[33]，可通過傅里葉變換紅外光譜分析三文魚魚片肌原纖維蛋白二級結構的變化情況，如圖3所示，新鮮魚片的肌原纖維蛋白二級結構以β-折疊為主（相對含量55.68%），α-螺旋、β-轉角和無規卷曲的相對含量分別為14.99%、15.46%、13.62%，說明此時蛋白質的二級結構較穩定。隨著貯藏時間的延長，各處理組魚片蛋白質β-折疊相對含量均呈下降趨勢，無規卷曲、β-轉角相對含量呈上升趨勢，α-螺旋相對含量在14.99%～16.06%，這可能是蛋白質在氧化分解過程中，由于非共價鍵的相互作用，造成部分β-折疊向β-轉角和無規卷曲轉變[34]。空白組樣品的β-折疊相對含量在第12天降至44.01%，而β-轉角、無規卷曲相對含量分別上升至2 5.99%和15.34%，說明空白組魚片穩定的蛋白質二級結構遭到破壞，蛋白質發生了變性。在第12天，KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy涂膜處理三文魚魚片具有更高的規則二級結構比例，其α-螺旋與β-折疊相對含量之和明顯高于空白組和其他涂膜組樣品，說明ε-PL和Thy復合處理可有效地延緩蛋白質的氧化變性，對蛋白質的二級結構具有一定的保護作用[35]。

圖3 貯藏過程中魚片肌原纖維蛋白的α-螺旋（A）、β-折疊（B）、β-轉角（C）和無規卷曲（D）相對含量的變化Fig.3 Changes in percentages of α-helix (A),β-sheet (B),β-turn (C)and random coil (D) in MP from fish fillets during storage

2.4 貯藏過程中三文魚魚片肌原纖維蛋白熒光強度的變化

2.4.1 內源熒光、同步熒光光譜分析結果

色氨酸具有強熒光性和高敏感性等特點，因此，蛋白質內源熒光強度可以反映蛋白質三級結構的變化[36]。如圖4A所示，在貯藏12 d后，各組三文魚魚片肌原纖維蛋白熒光強度均明顯下降，這是由于貯藏過程中在微生物和內源酶的作用下，蛋白質氧化變性，空間結構發生變化，色氨酸暴露，蛋白質分子聚集，最終導致內源熒光強度下降[19]。其中空白組內源熒光強度下降幅度最大，復合涂膜組下降較為緩慢，KGM/SA＋ε-PL/KGM和KGM/SA＋Thy/KGM復合涂膜處理組無明顯性差異，KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy涂膜組的內源熒光強度明顯高于同期其他處理組，表明ε-PL和Thy的協同作用可以有效降低蛋白質中色氨酸的暴露，延緩蛋白質內源熒光強度下降，保護蛋白質的結構。

同步熒光光譜分析可表征蛋白質分子中熒光官能團以及附近微環境的變化，當固定激發波長和發射波長的間隔Δλ為15 nm時，同步熒光光譜可表征酪氨酸殘基的光譜特征[37]。如圖4B所示，三文魚魚片肌原纖維蛋白中酪氨酸殘基的特征熒光光譜峰位置發生了不同程度的藍移，說明酪氨酸殘基所在的微環境發生了改變，疏水性增強[38]。這可能是由于蛋白質氧化變性引起的空間結構改變。其中KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy涂膜組的同步熒光強度明顯高于其他處理組，說明ε-PL和Thy復配有助于延緩酪氨酸殘基所在微環境的變化，進而延緩了蛋白質的氧化變性。

圖4 鮮樣和貯藏12 d后魚片肌原纖維蛋白的內源熒光光譜（A）和同步熒光光譜（B）Fig.4 Fluorescence spectra (A) and synchronous fluorescence spectra (B)of MP from fish fillets fresh and stored for 12 days

2.4.2 三維熒光光譜分析結果

三維熒光光譜能同步記錄熒光強度隨激發波長和發射波長變化的熒光信息[39]。峰A熒光強度表示蛋白質肽鏈結構的致密性，峰B熒光強度表示酪氨酸和色氨酸殘基的水平[40-41]。如圖5所示，與鮮樣相比，在貯藏12 d后，各組樣品的峰A和峰B的熒光強度均明顯下降，說明在貯藏過程中，在微生物和內源酶的作用下，蛋白質發生了降解，熒光強度降低[42]。其中空白組熒光強度下降幅度最大，KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy涂膜組樣品峰A和峰B的熒光強度明顯高于貯藏12 d的其他樣品，說明ε-PL和Thy復配能更有效地保護蛋白質的結構，延緩蛋白質氧化變性，這與內源熒光和同步熒光光譜分析結果一致。

圖5 鮮樣和貯藏12 d后魚片肌原纖維蛋白的三維熒光光譜和等高線圖Fig.5 3D fluorescence spectra and contour plots of MP from fresh and fish fillets stored for 12 days

3 結論

本實驗以KGM和SA為成膜基質，以Thy和ε-PL為保鮮劑，制備了三明治型復合保鮮涂膜，研究了復合涂膜對三文魚魚片蛋白氧化程度的影響。與空白組相比，復合涂膜處理后的三文魚魚片肌原纖維蛋白的活性巰基含量、蛋白質溶解度、Ca2＋-ATPase活力下降減緩；表面疏水性和羰基含量較低；熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜結果表明，蛋白質的三級結構和二級結構較完整。研究表明，涂膜處理有效延緩了蛋白質氧化變性，其中，KGM/SA＋Thy/KGM復合涂膜的抗蛋白質氧化性能優于KGM/SA＋ε-PL/KGM復合涂膜。經KGM/SA＋ε-PL/KGM＋Thy復合保鮮劑涂膜處理后，魚片貯藏后期的各項蛋白氧化指標均優于同期單一保鮮劑復合涂膜處理樣品，說明ε-PL和Thy有協同增效作用，有效地緩解了貯藏過程中蛋白質氧化變性，提高了三文魚魚片的貯藏品質。