食品危害物重組抗體的親和力提升策略研究進展

王 鋒，謝 曦，馬路凱，王 琴，肖更生，沈玉棟，徐振林，王 弘,*

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，農業農村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室，廣東 廣州 510225；2.華南農業大學食品學院，廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

基于抗原-抗體識別的免疫分析方法是可用于食品抽查檢測的快速檢測技術，其具有操作簡單、高特異性、高靈敏度和高通量等優點。抗體作為免疫分析的核心試劑，已被廣泛應用于食品中多種危害物的快速檢測。目前，基于特異性抗體建立了酶聯免疫分析、化學發光免疫分析、熒光免疫分析、電化學免疫分析等多種方法，實現了食品中多種危害物的靈敏、快速和高通量檢測[1-4]。包括多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體、納米抗體在內的多樣化抗體被大量研發和應用，抗體制備技術經歷了從隨機非定向制備多克隆抗體到定向制備重組抗體（單鏈抗體、抗原結合片段（antigen-binding fragment，Fab）抗體、納米抗體等）的跨越式發展[5-7]。然而，食品危害物不僅包括小分子質量的農藥、獸藥和生物毒素等，還包括具有大分子特征蛋白的食品致病菌、過敏原等，不同特性的危害物增加了重組抗體制備的難度[8-9]。一些重組抗體對分析物的親和力較低，限制了其在免疫分析中的應用及其免疫快速檢測產品的開發[10]。

抗體親和力是抗體與抗原之間的特異性結合的能力，體現了兩者特異性識別作用的強弱，在目標分析物的定量分析、抗體的進化改造、免疫分析方法的建立及快速檢測產品的開發等領域具有重要的研究意義和應用價值[11]。提升重組抗體親和力可以突破現有重組抗體親和力不佳的局限性，拓寬原始抗體的生物活性和應用價值。本文概述食品危害物重組抗體的制備技術，從重組抗體突變進化、突變庫篩選、多價抗體及融合蛋白自組裝等方面闡述重組抗體親和力的提升策略，探討重組抗體親和力提升研究面臨的技術瓶頸，并對該領域研究方向進行展望。

1 食品危害物重組抗體的制備技術

食品危害物的重組抗體作為一種已知氨基酸序列的基因工程抗體，主要包括單鏈抗體、Fab、納米抗體等，可以通過抗體基因克隆和抗體庫篩選兩種方式制備（圖1）[12-13]。抗體基因克隆技術主要是利用抗體簡并引物對目的基因進行擴增，再通過外源表達獲得重組抗體；而抗體庫篩選技術是以前期構建的抗體庫為基礎，通過噬菌體展示技術、酵母展示技術、核糖體展示技術等多種策略實現重組抗體的制備[14-15]。與抗體基因克隆技術相比，抗體庫篩選技術具有更高的制備效率，獲得的重組抗體具有更高的抗原特異性和抗體多樣性。以農藥、獸藥、重金屬、生物毒素為代表的小分子類危害物具有較小的分子質量，一般采用動物免疫策略來提高重組抗體制備的有效性，其重組抗體制備存在一定的難度；以食源性致病菌和過敏原為代表的大分子類危害物，其特征蛋白具有多個抗原決定簇，重組抗體的制備較為容易，但針對單個抗原決定簇的抗體不易獲得。因此，食品危害物重組抗體的制備技術較為單一，通過上述方式制備的重組抗體存在非定向性和非精準性，一般來說重組抗體親和力具有很大的提升空間。

圖1 食品危害物重組抗體種類及其制備技術Fig.1 Types of and preparation technologies for recombinant antibodies against food hazards

2 食品危害物重組抗體的親和力提升策略

食品危害物重組抗體的親和力決定了免疫分析方法檢測靈敏度，對于食品危害物的快速檢測具有重要意義。作為一種基因工程抗體，食品危害物重組抗體具有結構簡單、易于通過基因工程手段進行改造等特點，可以通過重組抗體突變進化、重組抗體突變庫篩選、常規多價重組抗體、重組抗體融合蛋白自組裝等策略實現重組抗體親和力的提升（圖2）。

圖2 重組抗體親和力提升的幾種策略Fig.2 Several strategies for improving the affniity of recombinant antibodies

2.1 重組抗體突變進化提升親和力

與傳統抗體（多克隆抗體、單克隆抗體）相比，重組抗體在分子水平上的突變進化非常簡單[16]。重組抗體關鍵氨基酸位點的鑒定是抗體突變進化的關鍵，利用抗體同源模建和分子對接技術獲得抗體-目標物關鍵識別位點的定位[17]，進而利用抗體單點突變或多點突變對原始抗體進行改造，實現高親和力新抗體的制備和突破抗體親和力不高的限制[18-20]。鄧龍等[21]通過同源模建得到克百威農藥單鏈抗體抗體的三維模型，并利用分子對接技術將其與小分子農藥進行對接，發現疏水作用和氫鍵能夠極大影響該抗體的親和力。基于虛擬突變技術確定了關鍵氨基酸殘基重鏈Arg40和輕鏈His38及突變氨基酸殘基重鏈Leu40和輕鏈Leu38，突變后單鏈抗體親和力提高了2.23 倍。王方雨等[22]利用同樣方法確定新霉素單鏈抗體的一個關鍵氨基酸殘基為Leu227，并將其突變為Asp227，突變體的靈敏度提高了16.6 倍。He Xin[23]、Wang Jianping[24]和Xie Sanlei[25]等分別將羥氨芐青霉素單鏈抗體、沙拉沙星單鏈抗體和金剛烷胺單鏈抗體的關鍵氨基酸位點進行突變，提升了這些抗體對11 種青霉素類藥物、12 種氟喹諾酮類藥物和金剛烷胺的親和力，基于突變抗體的免疫快速檢測方法靈敏度提高了3.9～7.0 倍。鏈霉親和素的Fab抗體經過定點突變后，其親和力提高了6.3～10.7 倍[26]。針對結構更為簡單的納米抗體，其關鍵位點氨基酸可以影響目標物特異性識別口袋腔的形成及相互作用力，進而影響納米抗體的親和力[27-28]。黃曲霉毒素B1納米抗體的兩個關鍵氨基酸經定點突變后，檢測靈敏度分別提高2.3 倍和3.3 倍，并利用核磁共振技術闡述了納米抗體對黃曲霉毒素B1的特異性識別機制[29]。納米抗體的晶體結構能夠很好地闡釋關鍵氨基酸位點對抗體-抗原特異性結合的重要影響[30-31]。盡管重組抗體的制備存在不確定性，但仍可通過鑒定其關鍵氨基酸位點并經過抗體的定點突變最終實現重組抗體親和力的進化提升（圖3）。

圖3 不同抗體與目標分子的對接模型Fig.3 Docking models of different antibodies and target molecules

2.2 利用重組抗體突變庫篩選高親和力重組抗體

基于重組抗體突變庫的抗體親和力成熟策略主要是利用原始抗體的基因框架，進行突變庫的設計合成和高親和力抗體的制備[32-34]，這樣既在一定程度上保證抗體特異性，又可以增加目標物抗體的多樣性[35]。重組抗體突變庫的高效設計合成是利用重組抗體突變庫篩選高親和力抗體的關鍵。目前，抗體突變庫的設計方法主要有隨機突變、飽和突變、NNK突變（N代表4 種核苷酸，K代表核苷酸C/G）、NNY突變（Y代表核苷酸C/T）等，而抗體突變庫的設計模式、庫容大小、多樣性及篩選方法等都會影響高親和力抗體的篩選（表1）。焦凌霞等[36]首先基于分子對接確定了蘇云金芽孢桿菌毒素Bt Cry1Ac單鏈抗體與5 種Cry1毒素蛋白（Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1E和Cry1F）的共同關鍵氨基酸位點為Tyr104、Phe105和Tyr107，隨后利用三位點共同突變構建了高質量突變庫用于高親和力單鏈抗體篩選，這與Bt Cry1單鏈抗體的突變體篩選研究一致[37]。針對蘇云金芽孢桿菌毒素Bt Cry1B抗獨特型單鏈抗體與昆蟲蛋白BBMV結合能力不高的問題，仲建鋒等[38]利用熱點氨基酸構建Cry1B抗獨特型單鏈抗體飽和突變庫，篩選獲得高親和力突變體Y124G。龐倩等[39]針對黃曲霉毒素B1納米抗體的CDR2和CDR3區引入部分隨機突變，構建了高質量突變庫，篩選得到的15 種新納米抗體中有4 種親和力有明顯提高。吳紅靜等[40]利用易錯聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）并優化了突變條件，構建了突變均衡的納米抗體隨機突變庫，篩選獲得檢測信號提高2.1 倍以上的8 種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇納米抗體突變體。陳姣等[41]利用納米抗體CDR3的NNY突變方式構建了高庫容飽和突變庫，并分析了突變前后的功能多樣性。Qiu Yulou[42]、Chen Feng[43]和Wang Xuerou[44]等利用NNK突變方式分別構建了多樣性較高的納米抗體飽和突變庫，篩選得到了針對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇模擬抗原、花生過敏原Ara h 3和赭曲霉毒素A的高親和力納米抗體突變體。Xu Chongxin等[45]同樣利用NNK突變方式將微囊藻毒素MC-LR納米抗體與重鏈可變區片段基因融合制備突變庫，篩選得到5 種高親和力的新型雙功能重組抗體。基于抗體突變庫的高親和力抗體篩選策略，同時借助噬菌體展示技術、酵母表面展示技術等并結合液相磁珠篩選、熒光篩選等高效淘篩技術，可以避免隨機突變的完全非定向性，在一定程度上既保證了抗體的高特異性，又提高了高親和力抗體篩選的定向性和高效性。

表1 食品中危害物重組抗體突變庫的構建及高親和力抗體篩選的研究進展Table 1 Progress in the construction of recombinant antibody mutation library for hazardous substances in foods and the screening of high-affinity antibodies

2.3 制備常規多價重組抗體提升親和力

重組抗體結構簡單、分子質量較小，通過抗體基因的多價串聯或納米材料修飾方式很容易獲得常規的多價抗體（圖4），可以有效提高其與抗原的結合能力，也是提高重組抗體親和力和功能活性的有效手段[46-48]。Yajima等[49]利用連接肽將植物核盤菌的單鏈抗體基因串聯制備二價單鏈抗體，分析物結合活性提高為原來的2 倍。吳鵬等[50]利用類似方法制備二價納米抗體用于綿羊肌肉生長抑制素分析。Huang Yunxiang等[51]采用基因串聯方式制備了二價、三價和四價納米抗體用于駝科動物抗體的親和純化。He Jinxin等[52]采用串聯方式制備四溴雙酚A二價和三價生物素化納米抗體用于細菌磁性顆粒的修飾標記，二價和三價納米抗體磁性標記物的親和力分別是單體的3.4、11.4 倍，極大提高了原有納米抗體的結合活性和分析檢測靈敏度；隨后，He Jinxin等[53]又利用該策略制備了擬除蟲菊酯代謝物3-苯氧基苯甲酸的生物素化三價納米抗體，并將其應用于生物素-鏈霉親和素系統的酶聯免疫分析方法的建立，檢測靈敏度提高3.6 倍，說明納米抗體的多價形式可以通過增加其結合能力來提高其與目標物的親和力。此外，新型納米材料被廣泛用于標記修飾重組抗體來提高抗體親和力，通過不同的修飾方式可以實現重組抗體的非定向標記和定向標記，且不同材質、粒徑、形貌等材料特性均會影響其親和力[54-57]。

圖4 多價重組抗體示意圖Fig.4 Schematic diagram of multivalent recombinant antibodies

2.4 重組抗體融合蛋白的自組裝作用提升親和力

盡管常規多價重組抗體的研究已有報道，但利用基因多級串聯方式制備多價抗體仍存在表達量較低、生物活性不高、特異性較低等不足。目前，利用特定天然多肽或功能化蛋白制備抗體融合蛋白，進而實現抗體融合蛋白的自組裝作用，也是提升原始抗體親和力的有效策略[48,58-59]。納米抗體具有結構簡單、分子質量小等特性，通過基因重組方式制備多價納米抗體，有效提高其親和力和生物活性。以亮氨酸拉鏈、右手螺旋多肽、軟骨寡聚基質蛋白、C4結合蛋白、腸出血性大腸桿菌VT1B亞單位、鐵蛋白亞基等為抗體融合蛋白骨架（圖5），可以實現重組抗體融合蛋白的自組裝多聚體，避免了多價抗體的無序排列和生物活性干擾等[60-66]。Blanco-Toribio[67]、Alvarez-Cienfuegos[68]等利用人膠原蛋白XVIII的三聚域多肽制備獲得單鏈抗體和納米抗體的三聚體，多聚體生物活性顯著提高。武文[69]、張俊毅[70]等分別將脂多糖納米抗體基因、赭曲霉毒素A納米抗體基因與VT1B基因融合重組，制備的納米抗體五聚體能與目標物特異結合，親和力和生物活性顯著提高。Li Zhenfeng[71]、Bao Kunlu[72]等分別將C4結合蛋白與四溴雙酚A納米抗體-納米熒光素酶雙功能蛋白、赭曲霉毒素A納米抗體基因進一步融合表達，制備得到融合蛋白七聚體，二者方法的靈敏度分別提高7.00 倍和26.54 倍。來源于嗜熱古菌的鐵蛋白能夠自組裝成籠型結構的二十四聚體，具有較強的穩定性和親和力，利用鐵蛋白展示多價納米探針可以顯著提高納米探針的親和力和生物活性。Wang Feng等[73]將鐵蛋白亞基與細交鏈孢菌酮酸毒素的納米抗體-納米熒光素酶雙功能蛋白進一步融合表達制備融合蛋白的二十四聚體，檢測靈敏度提高了10.5 倍，驗證了鐵蛋白作為多價抗體骨架展示納米抗體的有效性。抗體自組裝多聚體作為一種親和力提升新策略，通過對自組裝骨架多肽/功能蛋白的優化調控，構建骨架有序集成的抗體多價組裝體，可以有效提高抗體的生物活性。

圖5 納米抗體及其融合蛋白的自組裝多聚體Fig.5 Nanobody and self-assembled multimers of its fusion proteins

3 食品危害物重組抗體親和力提升的技術瓶頸

3.1 重組抗體突變及突變庫篩選時關鍵識別位點較難確定

重組抗體的關鍵氨基酸對抗體親和力具有重要影響[19,40,44]，因此利用重組抗體突變進化或突變庫篩選制備高親和力重組抗體，需要預先確定抗體特異性識別食品危害物的關鍵位點，進而對關鍵識別位點進行定向突變或隨機突變。目前，多采用SWISS-MODEL同源模建的方法進行抗體關鍵識別位點的分析，但該方法存在抗體模板較多、抗體三維結構模型不夠精確、分子對接不夠準確等缺點；AlphaFold/AlphaFold2是以深度神經網絡技術不斷優化抗體模型質量，獲得的抗體模型具有較高的精準性[74-75]，聯合這兩種分子模擬技術可以有效提高重組抗體模型的精準度和分子識別機制的準確度。此外，有研究通過蛋白結晶的方法獲得重組抗體的晶體結構[31,76-77]，進而確定抗體的關鍵識別氨基酸，此方法可以顯著提高重組抗體突變或突變庫篩選的效率和定向性。

3.2 多價重組抗體形式容易影響抗體活性

常規多價抗體和抗體自組裝形式均是通過制備多價重組抗體來提高抗體的親和力，而利用重組抗體修飾納米材料也可制備獲得多價重組抗體。常規多價抗體多采用抗體串聯方式，但由于抗體亞基空間結構的交叉及無序排列，在一定程度上會影響多價重組抗體的活性[52-53]。以活性多肽片段等為骨架，可以通過抗體自組裝獲得多價重組抗體，避免了多個抗體的無序排列，可實現納米抗體多聚體的自組裝[65,78]；但隨著重組抗體多聚體的進一步形成，高聚體的生物活性會受到多個抗體亞基的影響，低聚體的生物活性可能會高于多聚體生物活性，這與不同重組抗體的結構有很大關系。盡管利用納米材料標記重組抗體可以獲得多價重組抗體，但常常需要經過特定的化學偶聯反應，對抗體的生物活性會產生一定的影響。因此，盡可能采用抗體自組裝策略制備多價重組抗體，同時要考慮到重組抗體低聚體和重組抗體高聚體的區別與聯系。

3.3 不同危害物或不同類型重組抗體的親和力提升策略不具有普適性

食品中農藥、獸藥、重金屬、生物毒素、食源性致病菌和過敏原等危害物嚴重影響著食品營養品質和質量安全。不同食品危害物的重組抗體在蛋白序列同源性和三維空間結構上具有很大的差異，這也會影響抗體的親和力和檢測性能[79-80]。不同危害物的重組抗體具有較高的識別特異性，具體表現為抗體-危害物的結合方式、關鍵氨基酸、相互作用力等多個方面。此外，單鏈抗體、Fab抗體和納米抗體在結構上既有較高相似性也有較大區別之處，這與不同類型重組抗體的生物特性有很大關系。因此，抗體突變進化、突變庫篩選、多價抗體及融合蛋白自組裝等策略僅可作為重組抗體親和力提升的可行性依據，對于不同食品危害物或者不同類型的重組抗體要選用多種研究策略進行分析比較。

4 結語

隨著現代農業與食品產業的高速發展，食品危害物呈現出種類繁多、污染范圍和水平廣、檢測難度大等特點。基于抗體的免疫檢測方法在食品危害物的高通量快速篩查領域有極大的應用前景。重組抗體作為一種特殊形式的基因工程抗體，可以實現抗體基因的突變進化、修飾改造和定向組裝。盡管重組抗體的研制具有一定的定向性和高效性，但如何進一步突破其親和力的限制仍是一個值得探究的科學問題，此外，如何研制高親和力抗體是食品安全快速檢測領域發展的重大需求。

目前，包括抗體突變進化、突變庫篩選、多價抗體及融合蛋白自組裝等在內的研究策略被應用于提升重組抗體親和力，但在高親和力抗體創制的定向性、高效性、便捷性及抗體親和力與特異性識別機制的關聯性等方面還需要不斷探索和闡述。以重組抗體晶體結構解析為基礎，利用重組抗體突變庫結合高效淘篩技術和定向突變技術制備獲得高親和力抗體，并構建重組抗體多價自組裝平臺，可以實現重組抗體親和力的多級提升。與單鏈抗體和Fab抗體相比，納米抗體作為一種結構更為簡單的新型重組抗體，具有較高的熱穩定性、有機溶劑耐受性和分析物高特異識別特性，在重組抗體親和力提升研究中更為便捷，在食品危害物免疫快速檢測中有很大的應用前景。此外，包括冷凍電子顯微鏡技術、現代光譜技術、高分辨質譜技術、X射線晶體衍射技術、非標記生物分子互作技術、AlphaFold/AlphaFold2技術等蛋白質分析及分子模擬技術為重組抗體的虛擬篩選及結構預測提供了極大的便利，為基于結構導向的高親和力重組抗體的制備提供了新的技術借鑒和研究策略。