馬氏珠母貝酶解產物品質改良工藝優化

陳柏宇，龔師芫，林海生，2*，秦小明，2，饒夢微，伍 彬，2，張 靜，2，陳文楚，張晨昕，李藝清

（1.廣東海洋大學 食品科技學院國家貝類加工技術研發分中心（湛江）廣東省水產品加工與安全重點實驗室廣東省海洋生物制品工程實驗室 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2.大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034）

馬氏珠母貝主要分布于我國廣東、廣西和海南沿海地區，目前采珠后剩余的貝肉大部分當作廢棄物丟棄，少部分被用作飼料或初加工后鮮銷，造成大量貝肉資源浪費[1]。馬氏珠母貝肉營養豐富，富含蛋白質和呈味氨基酸，蛋白質經酶解后能夠產生大量對人體有益的活性肽，是開發天然海鮮調味料的理想原料。目前，國內已開展了許多相關馬氏珠母貝的研究，如揮發性風味物質[2]、營養組成[3]以及功能特性[4-5]等。

由于貝類酶解液腥味較濃苦味較重，對海鮮調味料的開發與應用具有很大的限制。徐律等[6]采用活性炭聯合安琪高活性酵母對菲律賓蛤仔酶解液進行脫腥，脫腥后酶解液基本沒有腥味，脫腥液比較澄清。劉洪亮等[7]以貽貝為原料，利用3%茉莉花茶水和1%姜汁復合液，在溫度40 ℃下反應100 min進行脫腥，并在此基礎上進行調味工藝研究。袁林等[8]以牡蠣酶解產物為原料進行美拉德反應條件探討，最佳條件為在初始pH 6.97、114.62 ℃下和質量比1∶1的還原糖（木糖-葡萄糖質量比2∶1）反應29.43 min，得到的美拉德產物具有貝香味、肉香味和海鮮味。而作為新型理想原料的馬氏珠母貝，對其在風味改善研究幾乎未有，具有很好的研究前景和意義。

本研究將通過多手段（漂燙、美拉德反應改良、酵母脫腥、氣味掩蓋處理）協同對馬氏珠母貝酶解產物風味進行改善，并采用電子舌、電子鼻、游離氨基酸和揮發性物質測定，并輔以感官評價，來對比改善前后馬氏珠母貝酶解物風味的變化，旨在為馬氏珠母貝肉的開發利用及產業化提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬氏珠母貝（Pinctada martensii）：湛江市雷州流沙灣養殖場，鮮活開殼取肉，于-80 ℃冷凍備用；動物蛋白酶（酶活1.0×105U/g）、中性蛋白酶（酶活1.0×105U/g）：廣西南寧龐博生物公司；葡萄糖、果糖、蔗糖（均為分析純）：常德比克曼生物科技有限公司；安琪高活性干酵母（食品級）：安琪酵母股份有限公司；蒜、姜提取物（食品級，濃度1%）：武漢冠贏生物科技有限公司；氫氧化鈉、L-谷氨酸、茚三酮（均為分析純）：廣東汕頭西隴化工公司。

1.2 儀器與設備

JA2003型電子天平：上海恒平科學儀器有限公司；HZ-9212S型恒溫振蕩器：太倉市科教器材廠；PB-10型pH計：德國SartoriuS公司；UV-2102PC型紫外分光光度計：尤尼克（上海）儀器有限公司；SA402B型電子舌：日本Insent公司；島津TQ8050NX型氣相色譜-質譜聯用（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：南寧藍天實驗設備有限公司；PEN3型電子鼻：北京盈盛恒泰科技有限責任公司；2-16KL型臺式冷凍高速離心機：北京東迅天地醫療儀器有限公司；T-18型均質機：上海楚柏實驗室設備有限公司；N-1100V-W型旋轉蒸發儀：岐昱實業上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬氏珠母貝酶解條件

參考司蕊等[2]的酶解方法，取新鮮馬氏珠母貝肉，洗凈瀝干，按料液比1∶3（g∶mL）加水打漿、均質后，用0.5%氫氧化鈉調pH至7.0；依次加入動物蛋白酶（加酶量為1 500 U/g，酶解2 h，酶解溫度55 ℃）和中性蛋白酶（加酶量為1 500 U/g，酶解3 h，酶解溫度55 ℃）進行分步復合酶解，酶解結束后100 ℃水浴滅酶10 min，迅速冷卻至室溫，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，過濾，取上清液，制得珍珠貝酶解產物（enzymatic hydrolysate ofPinctada martensii，EHP）。

1.3.2 前處理方式對酶解效果的影響

馬氏珠母貝肉先分成兩份，分別采用熱水漂燙處理（100 ℃、5 min）和不作任何處理，參照1.3.1的酶解方法和條件制得EHP，最終分別測定兩種酶解產物的氨基酸態氮含量[9]，并進行感官評價及電子鼻和電子舌分析。

1.3.3 不同糖對美拉德反應改良EHP品質的影響

參考張勝男等[10]的方法，探討不同糖與EHP進行美拉德反應后感官、游離氨基酸態氮以及風味的變化。將上述1.3.1制好的EHP分成三份，分別加入8%的蔗糖、果糖和葡萄糖，用0.5%氫氧化鈉調pH至7.0，100 ℃加熱30 min，冰浴冷卻至室溫。4 ℃、8 000 r/min離心20 min，過濾取上清液，分別測定其氨基酸態氮含量，并進行感官評價及電子鼻和電子舌分析。

1.3.4 酵母發酵順序對美拉德發酵液風味的影響

（1）先美拉德后酵母組：參考徐律等[11]的方法，將酶解產物按照1.3.3進行美拉德反應后，接種0.5%的酵母在40 ℃發酵1 h；

（2）先酵母后美拉德組：將酶解產物接種0.5%的酵母，在40 ℃發酵1 h后，按照1.3.3進行美拉德反應。

兩種不同方式獲得的產物，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液分別得到兩種不同美拉德發酵液，分別測定氨基酸態氮含量，并進行感官評價及電子鼻和電子舌分析。

1.3.5 氣味掩蓋法對EHP品質的影響

經漂燙后的馬氏珠母貝肉勻漿，用0.5%氫氧化鈉調pH為7.0，每個樣品取30 g，分別在酶解前、美拉德反應前、酵母發酵前及發酵后，按照質量分數2%添加蒜、姜提取物（兩者比例為1∶1），50 ℃恒溫加熱10 min[12-13]，反應結束后分別在4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min，取上清液。分別測定氨基酸態氮含量，并進行感官評價。

為進一步探討不同蒜、姜提取物的最佳比例，酶解物經美拉德反應后，分別按照質量分數2%添加不同比例（質量比3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）的蒜提取物與姜提取物，經酵母發酵后，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液，分別測定氨基酸態氮含量，并進行感官評價及電子鼻和電子舌分析，從而確定最佳蒜、姜提取物的最佳比例。

1.3.6 分析檢測

（1）感官評價

參考饒夢微等[14]的方法，感官評定鑒評小組由10名評定員（系統學習過感官評定課程，有豐富的感官評定經驗）。對酶解液的顏色、氣味、滋味等進行綜合評價，按等級進行打分評比。品評員漱口后，取待品評樣品2～3 mL于口中，品評10 s后吐出，再漱口后取參比液品嘗，具體感官評價標準見表1，最終評分為五項總和，滿分為25分。

表1 酶解液感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standards of enzymatic hydrolysates

（2）樣品滋味電子舌測定[3]

電子舌系統由6個味覺傳感器組成，分別是CA0（酸）、C00（苦）、AE1（澀）、AAE（鮮）、CTO（咸）及GL1（甜）。在每次檢測前，需要待傳感器完成自檢，在參比溶液（0.30 mmol/L酒石酸和30.00mmol/L氯化鉀混合溶液）中進行活化，待信號穩定，則認為數據有效。待測樣品配成質量濃度為1.00 g/L，按照系統預定程序進行檢測，以參比溶液和0.50 g/L谷氨酸鈉溶液作為對照，運用系統自帶程序對樣品進行測定與分析。

（3）樣品風味電子鼻測定[15]

取稀釋50倍后的樣液5 mL置于30 mL頂空瓶中，20～25 ℃密封一段時間進行頂空氣體生成，采用頂空抽樣的方法進行取樣并檢測。電子鼻在取樣的同時獲取并記錄數據，采樣時間為120 s，采樣結束后的數據點即為取樣數據。采樣后WinMuster軟件自動控制對傳感器陣列進行清洗，清洗時間為90 s，電子鼻各傳感器特性：W1C（芳香氣味）；W5S（氮氧化合物）；W3C（氨類）；W6S（氫化物）；W5C（烷烴芳香成分）；W1S（甲烷氣味）；W1W（硫化物）；W2S（醇類、醛酮類化合物）；W2W（有機硫化物）；W3S（烷烴）。

（4）游離氨基酸檢測[16]

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》進行測定。

（5）揮發性風味物質的測定

參照袁林等[17]的方法采用固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）提取樣品中揮發性物質。固相萃取頭預處理30 min后進行老化（250 ℃）。稀釋5倍后的樣品置于頂空瓶，加入2 μL壬酸甲酯溶液（溶于正戊烷，質量分數為10 μg/g）進行定量，60 ℃恒溫萃取35 min。然后取出萃取頭并直接插進氣相色譜-質譜聯用儀進行解吸和分析，解吸時間為5 min。參照張迪等[18]的方法對GC-MS條件進行設置。

1.3.7 數據處理

采用SPSS 20.0軟件對數據進行方差分析和顯著性分析，實驗結果利用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 前處理方式對酶解液品質的影響

氨基酸態氮是以氨基酸形式存在的氮元素，而蛋白質在酶解等過程中生成短肽和氨基酸，可通過測定游離氨基酸態氮總量判斷酶解物水解程度及反應變化。不同前處理方式對酶解液品質的影響結果見圖1。

圖1 前處理方式對酶解液品質的影響Fig.1 Effect of pretreatment modes on the quality of enzymatic hydrolysates

由圖1A可知，漂燙組的整體感官評分較高，能夠降低氨基酸態氮含量。林海生等[19]在牡蠣酶解物制備時也發現加熱會導致氨基酸態氮含量的下降，水產蛋白質結構中（肌球蛋白、肌動蛋白）含有較多的-SH基，熱處理容易使松散的蛋白質肽鏈重新結合，最終導致氨基酸態氮有所降低。由圖1B可知，與未漂燙相比，漂燙后再進行酶解制得酶解物中香氣成分的含量有所不同，但是主要成分極為相似，其中氮氧化合物和硫化物兩個傳感器上的響應值尤為突出，其次芳香氣味也略高于其他傳感器的響應。表明漂燙后再進行酶解使得酶解物中具有較高的硫化物氣體以及芳香物質。由圖1C可知，滋味特性變化規律與相關報道結果一致，漂燙后進行酶解能夠降低酶解產物的腥味即表面的三甲胺和土腥味[20]。因此，下一步研究采用漂燙對珍珠貝肉前處理后開展美拉德反應工藝研究。

2.2 不同糖對酶解液品質的影響

不同糖對酶解液品質的影響見圖2。由圖2A可知，蔗糖處理酶解物的感官評分更佳，與其他糖之間有顯著性差異（P＜0.05）。由圖2B可知，蔗糖處理酶解物的綜合效果更好，不良風味成分較少，W5S和W5C感受器反應尤為明顯，說明不同糖類和蛋白質發生不同程度的美拉德反應，產生了醛類、酚等氮氧化合物以及硫化物。且蔗糖處理美拉德反應氨基酸態氮含量相對最低，與電子鼻分析結果相符。顧聆琳等[21]在探討美拉德反應制備牡蠣調味料中，也得到相似結果。由圖2C可知，不同糖處理的酶解液在滋味上沒有顯著差異。所以選擇最佳糖類為蔗糖。

圖2 不同糖對酶解液品質的影響Fig.2 Effect of different sugar on the quality of enzymatic hydrolysates

2.3 酵母發酵順序對酶解液品質的影響

酵母添加順序對酶解液品質的影響見圖3。由圖3A可知，美拉德反應前進行酵母發酵感官評分更高，而美拉德反應后進行酵母發酵氨基酸態氮含量更低，可能是在美拉德反應中，蛋白質等進一步降解生成小分子物質，有利于酵母生長。由圖3B可知，電子鼻分析結果表明，先美拉德反應后再進行酵母發酵能夠提高酶解物風味，表現出較強的硫化物和醇香氣味。由圖3C可知，美拉德反應前進行酵母發酵的酸味、咸味、鮮味有所下降。綜上，酶解液在美拉德反應后利于酵母生長，提高酶解物風味，因此本研究選擇先美拉德反應后再進行酵母發酵。

圖3 酵母發酵順序對酶解液品質的影響Fig.3 Effect of yeast fermentation sequence on the quality of enzymatic hydrolysates

2.4 蒜、姜提取物對酶解液品質的影響

2.4.1 蒜、姜提取物添加順序對酶解液品質的影響

蒜、姜提取物（添加比例為1∶1）添加次序對酶解物感官評分及氨基酸態氮含量的影響見圖4。由圖4可知，蒜、姜提取物在美拉德反應前和酵母發酵前添加的整體評分最高，而兩者相比，酵母發酵前添加蒜、姜提取物的氨基酸態氮含量更低，反應更充足，酶解液改良效果更優。且與其他組之間感官結果有顯著性差異（P＜0.05）。因此采用酵母發酵前添加蒜、姜提取物作為進一步探討的階段。

圖4 蒜、姜提取物添加次序對酶解液感官評分及氨基酸態氮含量的影響Fig.4 Effect of adding order of garlic and ginger extract on sensory score and amino acid nitrogen content of enzymatic hydrolysates

2.4.2 蒜、姜提取物添加比例對酶解液品質的影響

復合掩蓋物（蒜、姜提取物）添加比例對酶解液品質的影響見圖5。由圖5A可知，蒜、姜提取物添加比例為1∶1及比例為1∶3時，整體評分顯著高于與其他組（P＜0.05），且比例為1∶1時游離氨基酸態氮含量最高。由圖5B可知，蒜、姜提取物添加比例為1∶3能夠提高酶解物風味，表現出較強的硫化物和醇香氣味。硫化物閾值低，含多種不同風味，其內硫化物主要成分可能為三硫化物、二丙基二硫醚等[22]、半胱氨酸及蛋氨酸等反應物[23]，醇類物質主要來源于脂肪氧化分解以及糖、醛、氨基酸等物質的還原產物[24]。由圖5C可知，不同蒜、姜提取物添加比例對滋味影響不顯著。最終確定為蒜、姜提取物的添加比例為1∶3。

圖5 蒜、姜提取物比例對酶解液品質的影響Fig.5 Effect of garlic and ginger extract proportion on the quality of enzymatic hydrolysates

2.5 改良工藝對酶解液品質的影響

2.5.1 馬氏珠母貝肉酶解產物（EHP）和改良酶解液（I-EHP）對比

EHP經過上述漂燙處理、美拉德反應、酵母發酵和掩蓋法等多種方式協同處理的優化條件下，制得改良后的酶解產物（improved enzymatic hydrolysate，I-EHP），改良前后各指標測定結果見圖6。由圖6A可知，I-EHP感官評分由17.0分上升至19.4分，氨基酸態氮含量由99 mg/100 g下降至74 mg/100 g。由圖6B可知，I-EHP表現出較強的甲烷氣味、醇香氣味等，而芳香氣味與硫化物弱于EHP。而電子舌分析結果顯示I-EHP的酸、甜、苦、澀味都得到相對的改善，鮮味與EHP相比有提升。說明經過多種方式改良有助于改善酶解液的風味。

2.5.2 游離氨基酸含量

游離氨基酸是水產品重要呈味成分之一，其種類和含量不僅直接影響人們對水產品美味的感受，也決定其營養價值，必需氨基酸是衡量其營養價值的指標之一[25]。在食品中，各游離氨基酸具有獨特的味道，其呈味特性是由各種氨基酸的含量、閾值或者與其他成分之間的相互作用所決定的。工藝改良前后酶解液中游離氨基酸的種類與含量見表2。

表2 改良前后酶解液中游離氨基酸含量對比Table 2 Comparison of free amino acids contents in enzymatic hydrolysate before and after treatment mg/100 g

由表2可知，與EHP相比較，I-EHP總游離氨基酸含量減少，甜味和苦味氨基酸比例減少，鮮味氨基酸比例增加。高加龍等[26]研究發現，美拉德反應會使酶解液提高游離氨基酸含量，而奚寬鵬[27]研究發現，酵母發酵過程能夠利用部分游離氨基酸作為氮源進行增殖，因此最終導致游離氨基酸含量下降。與該文上述“酵母發酵順序對美拉德發酵液的影響”中先美拉德再酵母發酵導致游離氨基態氮含量下降的結果相一致（圖3A）。

由表2可知，多種方式協同改良前后酶解液的主要呈味氨基酸的種類及含量也發生了變化。EHP的主要呈味氨基酸為苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、甘氨酸，而I-EHP的主要呈味氨基酸為苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、谷氨酸。處理后鮮味氨基酸比例有所上升，甜味和苦味氨基酸比例有所下降，呈味氨基酸總量下降。綜上，結合EHP和I-EHP的呈味氨基酸含量及比例對比分析結果和感官評價結果，鮮味氨基酸比例上升是導致I-EHP感官評分較高的原因之一。

2.5.3 揮發性風味成分測定結果

馬氏珠母貝酶解液經多手段協同改良前后，采用GC-MS對其揮發性香氣成分進行測定，并結合質譜圖庫（SI≥85）分析，改良前后酶解液中各類別揮發性香氣成分測定結果見圖7。

圖7 改良前后酶解液中各類別揮發性香氣成分數量的對比Fig.7 Comparison of numbers of flavor components of enzymatic hydrolysate before and after treatment

由圖7可知，EHP含有72種揮發性風味化合物，包括醛類、芳香族類、酮類、醇類、烷烴類和其他類化合物。I-EHP含有99種揮發性風味化合物，包括醛類、芳香族類、酮類、醇類、烷烴類和其他類化合物。EHP和I-EHP分別檢測出22種和5種醛類物質。改良前后醛類物質減少的主要原因是蒸煮時溫度升高加速脂肪的熱降解和氧化從而產生醛類物質，而經過美拉德反應和酵母脫腥等步驟，高溫及酵母發酵利用會導致醛類物質的種類減少。醛類物質的氣味閾值非常低，對其他揮發性化合物產生非常重要同時也間接影響水產品的風味[28]；酮類物質主要由于不飽和脂肪酸的降解[29]，經過改良后，I-EHP種類略微增加；醇類物質種類大大增加，由17種升至31種，醇類多是脂質氧化降解的產物[30]，故推測其為產生變化的主要原因；烷烴類化合物主要來源于脂肪酸烷氧自由基的斷裂和遷移，改良后得到的I-EHP的烷烴類化合物的種類大量增加，共檢測出27種，但烷烴類化合物由于閾值高，對于風味的變化的影響很小[31]；芳香族化合物一般認為閾值較低，對風味貢獻較大。其中雜環類化合物一般認為來自美拉德反應，這與馬氏珠母貝酶解液的生產工藝有關，高溫促成了這些化合物的形成[32]；改良處理后芳香族化合物由于美拉德反應中還原糖與氨基酸等作用，種類上升，共有19種。而其他化合物主要包括揮發性酸類、酯類、醚類、呋喃類、噻唑類、含氮氧化合物等。這些化合物在種類和含量較少，因此被歸為一類。在改良處理后種類有所降低，可能某些成分進一步分解導致。

綜上，經過多種方式協同改良后的馬氏珠母貝酶解液的總體特征風味物質種類增加，含量顯著上升，與電子鼻結果對比趨勢相同。因此可以得出改良處理后可以改善酶解物的腥味并產生獨特風味，結合感官結果分析，可知酶解物的風味有所提高。

3 結論

本研究表明，原料漂燙處理后，制備的珍珠貝酶解產物經美拉德反應改良（8%蔗糖、溫度100 ℃、30 min）、酵母脫腥（添加量0.5%，40 ℃，60 min）和氣味掩蓋法（添加姜、蒜提取物，總量為酶解液的2%，蒜、姜提取物比例為1∶3）處理后感官評分（19.4分）提高，氨基酸態氮含量（74 mg/100 g）下降，綜合風味評價優于處理前的酶解液風味，主要呈味物質的組成及含量具有一定差異，對其呈味有重要影響。經改良處理后，酶解液游離氨基酸含量總體下降，甜味和苦味游離氨基酸比例分別降低了3.42%和3.81%，鮮味游離氨基酸比例增加了7.23%。通過質譜庫分析可知主要特征風味物質種類增加，含量顯著上升，與電子鼻結果對比趨勢相同。最后結合電子舌與感官評價結果，可以得出工藝處理后可以改善酶解物的腥味并產生獨特風味，風味有所提高。本研究通過對馬氏珠母貝海鮮醬的工藝優化及風味特性探究，為后續馬氏珠母貝肉的開發利用及產業化提供理論依據。