微熱輔助低溫等離子體殺菌技術(shù)對榨菜貯藏期品質(zhì)劣變的影響

趙 楠，葛黎紅，張愷熹，黃玉立，，侯新磊，梅 源，曾雪晴，王艷麗，彭燈水，顏正財(cái)，章建浩

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；3.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；4.吉香居食品股份有限公司，四川 眉山 620039）

榨菜作為世界三大醬菜之一，因其爽脆鮮香的獨(dú)特感官品質(zhì)深受國內(nèi)外消費(fèi)者喜愛[1]。榨菜的制作工藝是腌漬發(fā)酵的典型代表，干腌過程形成的高滲環(huán)境有效抑制了腐敗菌，使得乳酸菌和真菌成為優(yōu)勢微生物[2-4]。榨菜發(fā)酵完成后經(jīng)包裝進(jìn)入貯藏銷售環(huán)節(jié)，在物流過程中，乳酸菌的后發(fā)酵作用常引起發(fā)酵體系過酸問題，而真菌則會消耗還原糖和有機(jī)酸產(chǎn)生大量氣體并形成膜璞，極易引起包裝后產(chǎn)品的脹袋和膜璞腐敗，最終導(dǎo)致產(chǎn)品感官品質(zhì)與安全屬性的同時(shí)劣化[5-6]。因此，開發(fā)針對榨菜包裝產(chǎn)品的廣譜性有效殺菌技術(shù)對產(chǎn)品規(guī)模化生產(chǎn)與擴(kuò)大化銷售具有重要作用。

發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)目前常用的殺菌方式是以巴氏殺菌為代表的熱殺菌，輔以防腐劑的添加以達(dá)到抑菌目的。但熱強(qiáng)度常常導(dǎo)致榨菜出現(xiàn)質(zhì)構(gòu)軟爛、益生性下降等品質(zhì)問題，添加劑的使用也大大降低了產(chǎn)品的消費(fèi)者接受度[7]。近年來低溫等離子體殺菌（cold plasma sterilization，CPS）技術(shù)的出現(xiàn)為解決以上問題提供了新思路[8]。該技術(shù)是通過高壓電場產(chǎn)生的介質(zhì)阻擋放電效應(yīng)進(jìn)行食品冷殺菌的新型方式，具有安全、無污染、熱效應(yīng)低的特點(diǎn)[9]。CPS應(yīng)用于發(fā)酵蔬菜時(shí)，可殺滅包裝泡菜中的產(chǎn)氣真菌，并減少產(chǎn)膜真菌數(shù)量，但對乳酸菌的后酸化作用影響較小[10]。同時(shí)，放電效應(yīng)產(chǎn)生的臭氧也在不同程度上加速了產(chǎn)品色澤褐變與暗淡。微熱輔助低溫等離子體技術(shù)（mild heating-assisted cold plasma sterilization，MH-CPS）是將微熱與CPS結(jié)合，該技術(shù)通過采用低于巴氏殺菌的溫度（50～60 ℃）與低溫等離子體結(jié)合對食品進(jìn)行處理，可在強(qiáng)化殺菌效果的同時(shí)，弱化放電效應(yīng)引起的色澤劣化[11-12]。已有研究發(fā)現(xiàn)，相比于巴氏殺菌和CPS單獨(dú)處理時(shí)，微熱輔助介質(zhì)電場處理對包裝果蔬汁、果蔬干粉、鮮切果蔬制品中大腸桿菌[13]、單增李斯特菌[14]以及蠟樣芽孢桿菌[12]等致病菌具有更高殺菌率，且對產(chǎn)品感官品質(zhì)的破壞作用更小[15-17]。目前，有關(guān)MH-CPS殺菌技術(shù)在發(fā)酵食品中的應(yīng)用僅限于發(fā)酵乳制品領(lǐng)域，該技術(shù)在奶酪殺菌時(shí)可有效減緩質(zhì)地結(jié)塊和色澤褐變現(xiàn)象[18-19]。而MH-CPS在發(fā)酵蔬菜包裝產(chǎn)品中的殺菌效果及其對產(chǎn)品貯藏過程中品質(zhì)的影響還不明確。

因此，本研究以MH-CPS處理包裝榨菜樣品，通過與未殺菌（對照）、微熱殺菌（mild-heating strilization，MHS）、CPS、巴氏殺菌樣品作比較，分析榨菜經(jīng)不同殺菌方式處理后，在貯藏過程中的理化特性、微生物數(shù)量、質(zhì)構(gòu)色澤品質(zhì)變化及腐敗進(jìn)程，以期為開發(fā)適用于包裝榨菜產(chǎn)品的高效殺菌方式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮脫鹽榨菜（食鹽含量為3 g/100 g，總酸含量為0.25 g/100 g）：吉香居食品股份有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CPS-I型低溫等離子體滅菌系統(tǒng)：南京潤屹有限公司；2GN-75-K型包裝機(jī)：浙江利強(qiáng)包裝科技公司；TAXTPlus質(zhì)構(gòu)儀：英國Stable Micro System公司；S210SevenCompactTM型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榨菜的制備與殺菌

將榨菜切為8 mm×8 mm×15 mm大小的樣品置于包裝盒中密封，隨機(jī)分為五組。第一組不經(jīng)殺菌處理，記為對照組；第二組采用巴氏殺菌（80 ℃水浴30 min）處理，記為巴氏殺菌組；第三組采用CPS系統(tǒng)進(jìn)行殺菌，殺菌參數(shù)為：電壓140 kV，頻率50 Hz，時(shí)間12 min，記為CPS組；第四組采用微熱（55 ℃水浴15 min）殺菌，記為MHS組；第五組采用MH-CPS殺菌，樣品先進(jìn)行微熱處理再進(jìn)行CPS處理，記為MH-CPS組。采用高于常規(guī)貯藏溫度條件進(jìn)行加速貯藏實(shí)驗(yàn)，將殺菌后樣品置于37 ℃避光貯藏，在0、2 d、4 d、6 d分別取樣進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

（1）pH和總酸的測定[8]

取樣品3 g與27 mL去離子水混合、均質(zhì)，采用pH計(jì)測定pH。取樣品10 g與20 mL超純水混合、超聲提取10 min，過濾得上清液采用0.1 mol/L NaOH滴定，以乳酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以g/100 g表示。

（2）還原糖含量的測定[8]

取榨菜樣品10 g與20 mL超純水混合、超聲提取10 min，過濾得上清液，取2 mL上清液與1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸混勻后于沸水中保溫5 min，于波長540 nm處測定吸光度值。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程進(jìn)行還原糖含量計(jì)算，結(jié)果以g/100 g表示。

（3）亞硝酸鹽含量的測定[10]

取切碎5 g樣品與12.5 mL飽和硼砂溶液、480 mL 70 ℃去離子水混合，于沸水浴中提取15 min，冷卻后取上清液與5 mL亞鐵氰化鉀和5 mL乙酸鋅溶液分別混合，過濾得上清液。上清液中先后加入2 mL氨基苯磺酸溶液和1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，15 min后于波長538 nm處測定吸光值。以亞硝酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程進(jìn)行亞硝酸鹽含量計(jì)算，結(jié)果以mg/kg表示。

（4）氨基酸態(tài)氮含量的測定[10]

取切碎2 g樣品與15 mL超純水混合、超聲提取10 min，過濾得上清液，先加入0.1 mol/L NaOH將其pH調(diào)至8.2，而后加入10 mL甲醛，充分混勻后采用0.1 mol/L NaOH將混合物pH滴定至9.2，氨基酸態(tài)氮含量計(jì)算公式如下：

式中：M為NaOH濃度，mol/L；V為滴定NaOH消耗量，mL；W為樣品質(zhì)量，g；0.014是代表N元素的毫摩爾分子量，g/mmol。

（5）質(zhì)構(gòu)剖面分析[10]

采用質(zhì)構(gòu)分析儀，選用P36探頭，在TPA模式下，測前、測試、測后速度分別為1 mm/s、1 mm/s、2 mm/s，壓縮比例50%。記錄儀器反饋的硬度、咀嚼性數(shù)據(jù)。

1.3.3 微生物指標(biāo)的測定

細(xì)菌、乳酸菌、真菌的計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)[8]。在無菌條件下，將5 g樣品與25 mL無菌生理鹽水混合、均質(zhì)，適度稀釋后分別涂布于PCA培養(yǎng)基平板、MRS瓊脂培養(yǎng)基平板和孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基平板上。PCA培養(yǎng)基用于細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)，培養(yǎng)條件：30 ℃，72 h；MRS瓊脂培養(yǎng)基用于乳酸菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)條件：30 ℃厭氧，72 h；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基用于真菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)條件：（28±2）℃，48 h。產(chǎn)膜真菌計(jì)數(shù)參照現(xiàn)有方法[8]。挑取孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落，分別接種于YPD液體培養(yǎng)基上，于（28±2）℃培養(yǎng)48 h后觀察YPD液體培養(yǎng)基表面膜璞產(chǎn)生情況，若YPD液體培養(yǎng)基表面有膜璞漂浮，則判定該菌落為產(chǎn)膜真菌，計(jì)入產(chǎn)膜真菌數(shù)量。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

除質(zhì)構(gòu)采用8組平行外，其余指標(biāo)均采用3組平行，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)之間的差異顯著性，顯著性分析水平選取P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌方式對榨菜貯藏期色澤及腐敗進(jìn)程的影響

外觀可直接反映包裝榨菜在貯藏過程中色澤變化及微生物腐敗的進(jìn)程，經(jīng)不同殺菌處理的榨菜在貯藏前后色澤變化及腐敗情況結(jié)果見圖1。由圖1可知，與對照組相比，剛完成殺菌的榨菜中CPS組、MHS組和MH-CPS組均較好地保持了新鮮榨菜的外青內(nèi)赭色澤，而巴氏殺菌組略微泛白且失去光澤。貯藏過程使得榨菜色澤褐變，且表面可見白色膜璞，這與產(chǎn)膜真菌大量繁殖有關(guān)[6]。在貯藏6 d后，對照組樣品褐變嚴(yán)重，膜璞也積累最多，CPS和MHS組均有少量膜璞產(chǎn)生。MH-CPS組和巴氏殺菌組在貯藏完成后仍無膜璞生成，且MH-CPS組在貯藏全程維持了較好的榨菜色澤。這表明MH-CPS組不僅可有效抑制榨菜在貯藏過程中膜璞腐敗的發(fā)生，還可在一定程度上緩解色澤褐變。

圖1 經(jīng)不同殺菌處理的榨菜在貯藏前后的色澤變化及腐敗情況Fig.1 Color changes and spoilage of Zhacai after sterilization by different treatments during storage

2.2 不同殺菌方式對榨菜貯藏期還原糖含量的影響

還原糖是榨菜中微生物的主要碳源物質(zhì)，不同殺菌處理的榨菜在貯藏過程中的還原糖含量變化見圖2。由圖2可知，榨菜經(jīng)殺菌處理后，還原糖含量在貯藏期間均逐漸上升，源于微生物水解蔬菜組織多糖產(chǎn)生的還原糖[20]，由于微生物生長受限代謝減弱，還原糖溶出速度大于消耗速度，導(dǎo)致還原糖積累[10，21]。貯藏6 d后MH-CPS組和巴氏殺菌組還原糖含量均較大，說明這兩種殺菌條件下的后發(fā)酵和腐敗作用均受到明顯抑制。

圖2 不同殺菌處理對榨菜貯藏期還原糖含量的影響Fig.2 Effect of different sterilization treatments on reducing sugar contents of Zhacai during storage

2.3 不同殺菌方式對榨菜貯藏期總酸和pH的影響

總酸和pH可反映榨菜貯藏期間的后發(fā)酵作用，不同殺菌處理的榨菜在貯藏過程中的pH及總酸含量變化見圖3。

圖3 不同殺菌處理對榨菜貯藏期pH（A）和總酸含量（B）的影響Fig.3 Effect of different sterilization treatments on pH (A) and total acid contents (B) of Zhacai during storage

由圖3可知，在貯藏過程中，對照組pH高于其他組，MHS組樣品在貯藏期間略有上升。而CPS、MH-CPS組、巴氏殺菌組榨菜在貯藏期pH無明顯變化。這與對照組總酸含量在貯藏前期顯著下降的情況相對應(yīng)。這可能是由于膜璞腐敗真菌消耗有機(jī)酸，導(dǎo)致總酸下降而pH上升[22]。殺菌后樣品在貯藏后總酸均有所增加，說明后發(fā)酵作用維持了包裝榨菜在貯藏過程的酸度狀態(tài)。在貯藏6 d時(shí)，CPS、MHS組、MH-CPS組、巴氏殺菌組的總酸含量分別增加了16%、19%、26%和8%。根據(jù)總酸和pH結(jié)果可知，微熱與CPS單獨(dú)或聯(lián)合處理均有助于維持榨菜的酸性環(huán)境。

2.4 不同殺菌方式對榨菜貯藏期微生物數(shù)量的影響

不同殺菌處理的榨菜在貯藏過程中的菌落數(shù)量變化見圖4。

圖4 不同殺菌處理對榨菜貯藏期細(xì)菌（A）、乳酸菌（B）、真菌（C）和產(chǎn)膜真菌（D）數(shù)量的影響Fig.4 Effect of different sterilization treatments on bacteria (A),lactic acid bacteria (B),fungi (C) and film-producing fungi (D) of Zhacai during storage

由圖4可知，榨菜貯藏期間細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量無明顯差別，說明乳酸菌是樣品中的主要細(xì)菌。MHS和CPS單獨(dú)處理均對細(xì)菌和乳酸菌無明顯減菌作用。MH-CPS處理使得起始細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量分別降低了1.9 lg（CFU/g）和1.6 lg（CFU/g），在貯藏期間細(xì)菌和乳酸菌繼續(xù)減少，最終細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量分別比未殺菌榨菜低2.8 lg（CFU/g）和2.6 lg（CFU/g）。這得益于CPS的后殺菌效應(yīng)，即在貯藏過程中，放電介質(zhì)產(chǎn)生的氣體繼續(xù)殺滅微生物[23]。巴氏殺菌的即時(shí)殺菌效應(yīng)主要表現(xiàn)在將初始菌數(shù)量大幅度削減了3.9 lg（CFU/g），但對乳酸菌的繁殖代謝影響不大，因而乳酸菌數(shù)量在貯藏2 d后迅速上升。對于真菌，微熱或CPS處理殺菌效果有限，很難完全殺滅真菌。研究顯示CPS單獨(dú)處理對泡蘿卜中乳酸菌破壞作用不大，而對產(chǎn)氣真菌具有較好殺菌效果[10]，與本研究結(jié)果不同，說明CPS的殺菌效果因產(chǎn)品而異。對照組榨菜在貯藏期間有大量產(chǎn)膜真菌繁殖，各殺菌方式均實(shí)現(xiàn)了貯藏全程無產(chǎn)膜真菌生長的殺菌作用，但CPS、MHS和巴氏殺菌均無法有效抑制細(xì)菌和乳酸菌的增殖。MH-CPS組實(shí)現(xiàn)了貯藏全程無真菌狀態(tài)，同時(shí)有效抑制細(xì)菌和乳酸菌的增殖，達(dá)到了比巴氏殺菌更佳的效果。

2.5 不同殺菌方式對榨菜貯藏期質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的影響

榨菜硬度與咀嚼性的同時(shí)下降表現(xiàn)為易碎、無嚼勁的不良感官體驗(yàn)。不同殺菌處理的榨菜在貯藏過程中的硬度和咀嚼性數(shù)量變化見圖5。

圖5 不同殺菌處理對榨菜貯藏期硬度（A）和咀嚼性（B）的影響Fig.5 Effect of different sterilization treatments on hardness (A) and chewiness (B) of Zhacai during storage

由圖5可知，隨著貯藏時(shí)間延長，硬度和咀嚼性都隨之下降，巴氏殺菌組榨菜在貯藏后質(zhì)構(gòu)劣化最為嚴(yán)重，可能是由于熱效應(yīng)下細(xì)胞壁果膠溶出，引起植物組織機(jī)械強(qiáng)度下降[24]。MHS或CPS單獨(dú)處理也可減緩質(zhì)構(gòu)劣化，兩者結(jié)合可實(shí)現(xiàn)最佳的質(zhì)構(gòu)提升效果，貯藏6 d后榨菜硬度和咀嚼性比巴氏殺菌組分別提升了34%和44%。在蔬菜發(fā)酵過程中，一方面，真菌產(chǎn)生的酶類可降解植物組織化學(xué)組分；另一方面，內(nèi)生菌將侵入植物細(xì)胞內(nèi)部，直接形成物理性破壞，這些過程均可導(dǎo)致質(zhì)構(gòu)軟爛[25]。研究表明CPS處理可通過殺菌鈍酶作用提升鮮切果蔬的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)[26]。微熱作用可在不溶解細(xì)胞壁果膠的前提下，鈍化細(xì)胞壁降解酶類，從而維持植物組織完整度[24]。對物理性與化學(xué)性破壞的多效抑制作用使得MH-CPS處理法表現(xiàn)出了更佳的質(zhì)構(gòu)改善效果。

2.6 不同殺菌方式對榨菜貯藏期亞硝酸鹽含量的影響

亞硝酸鹽是榨菜中常見的食品安全危害因素，不同殺菌處理的榨菜在貯藏過程中的亞硝酸鹽和氨基酸態(tài)氮含量變化見圖6。

圖6 不同殺菌處理對榨菜貯藏期亞硝酸鹽含量（A）和氨基酸態(tài)氮含量（B）的影響Fig.6 Effect of different sterilization treatments on nitrite contents (A)and amino nitrogen contents (B) of Zhacai during storage

由圖6A可知，對照組亞硝酸鹽含量在貯藏6 d后較初始值增加了1.84倍。CPS組亞硝酸鹽在貯藏結(jié)束時(shí)增加了29%，高于其他組，這可能是由于CPS放電過程產(chǎn)生的氮氧化物為亞硝酸鹽生成提供了原料[10]。MHS組、MH-CPS組和巴氏殺菌組的亞硝酸鹽含量在整個(gè)貯藏過程中無明顯變化。氨基酸態(tài)氮是亞硝酸鹽的前體物質(zhì)，由蛋白降解產(chǎn)生，可指示亞硝酸鹽的潛在生成風(fēng)險(xiǎn)。由圖6B可知，巴氏殺菌組和MH-CPS組氨基態(tài)氮含量在整個(gè)貯藏進(jìn)程中無明顯變化，其他組均增長20%～30%。由于真菌是發(fā)酵蔬菜中產(chǎn)生蛋白酶的主要微生物[27]，MH-CPS以及巴氏殺菌對氨基態(tài)氮積累的抑制也與其對真菌的有效殺滅作用有關(guān)。

3 結(jié)論

相較于CPS和MHS處理，MH-CPS表現(xiàn)出了更優(yōu)越的殺菌效果，可完全殺滅榨菜中的真菌尤其是產(chǎn)膜真菌，并大幅度降低細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量，有效減緩產(chǎn)品的膜璞腐敗現(xiàn)象，在穩(wěn)定理化性質(zhì)的同時(shí)，抑制亞硝酸鹽和氨基態(tài)氮積累；與巴氏殺菌的熱處理破壞作用相比，MH-CPS還具有減緩榨菜硬度、咀嚼性劣化并保持色澤的優(yōu)勢。因此，MH-CPS處理發(fā)酵蔬菜具有改善貯藏穩(wěn)定性的潛力。