抗尖孢鐮刀菌貝萊斯芽孢桿菌P9培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化

劉 瑾，張朝正，趙 華

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

鐮刀菌屬（Fusarium），世界十大植物病原真菌之一[2]，其中，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是引起150多種植物枯萎病和根腐病的一種土傳性病害病原菌，屬于半知菌類鐮刀菌屬真菌[1]?；诩怄哏牭毒鷮ψ魑镉袊?yán)重的破壞性，防控尖孢鐮刀菌，對植物枯萎病和根腐病的防治具有非常重要的意義[3]。微生物菌劑以安全綠色、抗病抗逆、改善土壤微生態(tài)、提高品質(zhì)和產(chǎn)量的優(yōu)勢成為主要的防治手段[4-7]。目前，應(yīng)用于生物防治的菌株主要為生防真菌、生防細(xì)菌、生防放線菌三大類，例如假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、淡紫擬青霉屬（Paecilomyceslilacinus（Thom.）Samson）、叢枝根菌（Arbuscular mycorrhiza）、木霉屬（Trichodermaspp.）等。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是由GARCIA R等新命名的一種生防菌[8-9]，其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)植物生長，抑制病原菌，在飼料、醫(yī)藥、食品、植物保護(hù)、污水處理和生物防控等領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用[10-13]。作為生物防治菌株，貝萊斯芽孢桿菌分泌的某些膠原蛋白類物質(zhì)與生物膜形成有密切關(guān)系，使菌株的拮抗效果更好，植物根際定殖是生防菌株能力的體現(xiàn)[14-17]。目前，已有關(guān)于芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究報(bào)道，但不同菌株最佳發(fā)酵條件存在較大差異。黎燕珊等[18]優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HC-8的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，提高了該菌株的發(fā)酵產(chǎn)量，增強(qiáng)對尖孢鐮刀菌、煙草疫霉和輪狀鐮刀菌的拮抗效果。楊可等[19]利用響應(yīng)面法優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌TSC001的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，提高了發(fā)酵液的抑菌活性，增強(qiáng)了對黃瓜灰霉病的拮抗效果。貝萊斯芽孢桿菌的發(fā)酵液中除了含有少量的發(fā)酵代謝物質(zhì)外，還含有大量培養(yǎng)雜質(zhì)，其抑菌活性受到培養(yǎng)基中化合物的種類、比例及發(fā)酵培養(yǎng)條件參數(shù)的影響。因此，對貝萊斯芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化決定抑菌活性物質(zhì)含量的多少，可為其鑒定活性物質(zhì)及分離提純提供研究基礎(chǔ)。

本研究以對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌P9為研究對象，以其發(fā)酵液的抑菌效果為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法對其培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為尖孢鐮刀菌的綠色防控提供理論依據(jù)，為微生物農(nóng)藥的開發(fā)提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）：天津科技大學(xué)菌種保藏中心；貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）P9：由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化錳、氯化鈣、氯化鈣、可溶性淀粉、果糖、蔗糖、麥芽糖、大豆蛋白胨、瓊脂粉、硫酸銨、硫酸銅、硫酸鋅：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH7.0。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、K2HPO41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeCl20.5 g/L，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H1815高速離心機(jī)：湘儀離心儀器有限公司；HPX-9162MBE電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SY.45-NJB牛津杯（6 mm×8 mm×10 mm）：北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司；ME204電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；DELTA320 pH計(jì)：多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HNY-200B控溫?fù)u床：上海智能分析儀器制造有限公司；YS-40A干熱滅菌箱：天津天宇機(jī)電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 貝萊斯芽孢桿菌P9生長曲線的測定

取保藏的貝萊斯芽孢桿菌P9于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)36 h得到種子液。將貝萊斯芽孢桿菌P9種子液以3%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，在30 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)36 h，每隔3 h取樣，測定其OD600nm值，繪制貝萊斯芽孢桿菌P9的生長曲線。

1.3.2 貝萊斯芽孢桿菌P9抑菌發(fā)酵液及無菌濾液的制備

將貝萊斯芽孢桿菌P9種子液以3%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，在30 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)72 h后，5 000 r/min離心10 min去除菌體，取上清液過一次性使用無菌濾膜0.22 μm，得無菌發(fā)酵濾液。

1.3.3 貝萊斯芽孢桿菌P9抑菌活性的測定

采用牛津杯法測定貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵液的抑菌活性，在PDA平板活化培養(yǎng)尖孢鐮刀菌，30 ℃條件下培養(yǎng)5 d，使其鋪滿平板，然后將滅菌牛津杯均勻擺放于平板上，吸取200 μL貝萊斯芽孢桿菌P9無菌發(fā)酵濾液加入到牛津杯內(nèi)，30 ℃條件下培養(yǎng)72 h，通過十字交叉法[20]測量抑菌圈直徑。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定發(fā)酵條件為種子液接種量3%（V/V），30 ℃、160 r/min培養(yǎng)72 h。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別對培養(yǎng)基配方的碳源種類（葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖）及最佳碳源添加量（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）、氮源種類（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、硫酸銨）及最佳氮源添加量（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）、無機(jī)鹽種類（NaCl、KCl、CaCl2、MnCl2）及無機(jī)鹽添加量（0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L）[21]進(jìn)行優(yōu)化，并測量優(yōu)化后抑菌圈直徑。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，選取3個(gè)影響最大的因素可溶性淀粉含量（A）、酵母浸粉含量（B）、氯化錳含量（C），采用Design-Expert10.0.8軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成[22-25]。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design for fermentation medium optimization

1.3.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

固定基本發(fā)酵條件為：初始pH值為7、接種量3%、發(fā)酵溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵時(shí)間72 h，以抑菌圈直徑為考察指標(biāo)，分別考察初始pH值（5、6、7、8、9）、接種量（1.5%、3.0%、4.5%、6.0%）、發(fā)酵時(shí)間（24 h、48 h、72 h、84 h）、轉(zhuǎn)速（80 r/min、160 r/min、240 r/min、320 r/min）、發(fā)酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）對抑菌效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌P9生長曲線的測定

貝萊斯芽孢桿菌P9的生長曲線見圖1。由圖1可知，Bacillus velezensisP9在培養(yǎng)6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，在培養(yǎng)15 h時(shí)，進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體的OD600nm值達(dá)到最大，并基本保持穩(wěn)定，培養(yǎng)26 h后菌體進(jìn)入衰亡期，OD600nm值迅速下降。因此，確定貝萊斯芽孢桿菌P9最佳轉(zhuǎn)接時(shí)間為9 h。

圖1 貝萊斯芽孢桿菌P9的生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus velezensis P9

2.2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源及最佳碳源添加量的確定

碳源對于Bacillus velezensisP9發(fā)酵液抑菌性能的影響見圖2。

圖2 碳源種類（a）及可溶性淀粉添加量（b）對菌株P(guān)9發(fā)酵液抑菌性能的影響Fig.2 Effect of carbon source types(a)and soluble starch addition(b)on bacteriostatic performance of strain P9 fermentation broth

由圖2a可知，不同的碳源對貝萊斯芽孢桿菌P9所產(chǎn)的拮抗物質(zhì)均有影響，當(dāng)以蔗糖或果糖作為碳源時(shí)，分泌的拮抗物質(zhì)較少，對尖孢鐮刀菌的抑制能力較低；葡萄糖、麥芽糖作為碳源時(shí)，抑菌圈直徑略有提高；而以可溶性淀粉作為碳源時(shí)，抑菌圈直徑可達(dá)到9.0 mm，究其原因可能是，可溶性淀粉作為遲效碳源，避免了葡萄糖、果糖等單糖作為碳源時(shí)所產(chǎn)生的分解代謝阻遏效應(yīng)[26-28]。因此，確定最佳碳源為可溶性淀粉。由圖2b可知，隨著可溶性淀粉添加量在0～5 g/L范圍內(nèi)的增加，抑菌圈直徑逐漸增加；當(dāng)可溶性淀粉添加量達(dá)到5 g/L時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為10 mm；當(dāng)可溶性淀粉添加量＞5 g/L時(shí)，抑菌圈直徑開始下降。因此，確定最適可溶性淀粉添加量為5 g/L。

2.2.2 氮源及最佳氮源添加量的確定

氮源對于貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵液抑菌性能的影響見圖3。

圖3 氮源種類（a）及酵母浸粉添加量（b）對菌株P(guān)9發(fā)酵液抑菌性能的影響Fig.3 Effect of nitrogen source types(a)and yeast extract addition(b)on bacteriostatic performance of strain P9 fermentation broth

由圖3a可知，以硫酸銨為氮源時(shí)，菌株P(guān)9的OD600nm值較低，所產(chǎn)的拮抗物質(zhì)極少，抑菌圈直徑最?。划?dāng)以胰蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨為氮源時(shí)，抑菌圈直徑有所增加；酵母浸粉作為氮源時(shí)，抑菌圈直徑可達(dá)最大值，為9.4 mm。因此，確定最適氮源為酵母浸粉。由圖3b可知，當(dāng)酵母浸粉添加量在0～5 g/L范圍內(nèi)增加時(shí)，幾乎無抑菌圈產(chǎn)生；當(dāng)酵母浸粉添加量＞5 g/L，抑菌圈的直徑逐漸增加；當(dāng)酵母浸粉添加量為15 g/L時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為9.3 mm；當(dāng)酵母浸粉添加量＞15 g/L時(shí)，抑菌圈直徑逐漸減小。因此，確定最適酵母浸粉添加量為15 g/L。

2.2.3 無機(jī)鹽種類及最佳無機(jī)鹽添加量的確定

無機(jī)鹽對于貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵液抑菌性能的影響見圖4。

圖4 無機(jī)鹽種類（a）及MnCl2添加量（b）對菌株P(guān)9發(fā)酵液抑菌性能的影響Fig.4 Effect of inorganic salts types(a) and MnCl2 addition (b) on bacteriostasis of strain P9 fermentation broth

由圖4a可知，與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比，添加NaCl、KCl、CaCl2、MnCl2均有抑菌效果，但MnCl2在4種無機(jī)鹽中效果最明顯，此時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到11.59 mm。由圖4b可知，當(dāng)MnCl2添加量在1.0 g/L范圍內(nèi)增加時(shí)，抑菌圈直徑逐漸增加，表明MnCl2對菌株分泌拮抗物質(zhì)具有一定的促進(jìn)作用；當(dāng)MnCl2添加量為1.0 g/L時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為15.5 mm；當(dāng)MnCl2添加量＞1.0 g/L時(shí)，抑菌圈直徑逐漸減小，這表明菌株產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)有所抑制?？赡苁怯捎诘蜐舛鹊腗nCl2刺激了Bacillus velezensisP9對碳源的利用，使得Bacillus velezensisP9分泌更多的拮抗物質(zhì)，但是氯化錳添加量過高導(dǎo)致拮抗物質(zhì)與MnCl2產(chǎn)生反應(yīng)，拮抗效果逐漸降低[29]。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳MnCl2添加量為1.0 g/L。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，選取3個(gè)對貝萊斯芽孢桿菌P9產(chǎn)拮抗物質(zhì)影響較大的因素可溶性淀粉含量（A）、酵母浸粉含量（B）、氯化錳（MnCl2）含量（C）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 10.0.8軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，擬合得到的模型二次多項(xiàng)式方程為：

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests design for fermentation medium optimization

由表3可知，該二次回歸模型極顯著（P值＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P值=0.651 5＞0.05），說明所建立的模型擬合度較好，模型的決定系數(shù)R2=0.979 6，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.953 5，表明95.35%的響應(yīng)值變化能由該模型解釋，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為0.77%，說明試驗(yàn)與模型建立的方程擬合度良好，能用于分析和預(yù)測發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化。由P值可知，一次項(xiàng)A、B、二次項(xiàng)A2、B2、C2對抑菌圈直徑影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C對抑菌圈直徑影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)影響均不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對抑菌圈直徑影響程度為A＞B＞C。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，獲得發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉6.769 g/L，酵母浸粉18.088 g/L，氯化錳0.888 g/L。在此最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，抑菌圈直徑的預(yù)測值為12.79 mm。為便于實(shí)驗(yàn)操作，修正發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉6.8 g/L，酵母浸粉18.1 g/L，氯化錳0.89 g/L。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得抑菌圈直徑實(shí)際值為12.43 mm，基本符合模型預(yù)測值，說明該模型準(zhǔn)確度良好。

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

不同培養(yǎng)條件對菌株貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵液抑菌性能的影響見圖5。

圖5 不同培養(yǎng)條件對菌株P(guān)9發(fā)酵上清液抑菌活性的影響Fig.5 Effect of different culture conditions on antibacterial performance of strain P9 fermentation supernatant

由圖5a可知，隨著初始pH值在5～7范圍內(nèi)的升高，抑菌圈直徑逐漸增加；當(dāng)初始pH值為7時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為11.9 mm；當(dāng)初始pH值＞7時(shí)，抑菌圈直徑下降。究其原因可能是，過高或過低的初始pH值均對菌株產(chǎn)拮抗物質(zhì)有抑制作用，可能是由于過酸或者過堿的環(huán)境影響了菌體的生長及其生命活動(dòng)。因此，確定最佳的初始pH值為7。

由圖5b可知，隨著接種量在1.5%～4.5%范圍內(nèi)的增加，抑菌圈逐漸增加；當(dāng)接種量為4.5%時(shí)，抑菌圈直徑為12.6 mm；當(dāng)接種量＞4.5%時(shí)，抑菌圈直徑趨于平緩。因此，確定最佳接種量為4.5%。

由圖5c可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在24～48 h范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵液中并未產(chǎn)生抑菌圈，可能是因?yàn)榫w處于富集階段，并未產(chǎn)生拮抗物質(zhì)；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，抑菌圈直徑逐漸增加，表明發(fā)酵液中的拮抗物質(zhì)正在逐漸積累；發(fā)酵72 h后，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為14.7 mm，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞72 h，抑菌圈直徑趨于平穩(wěn)。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

由圖5d可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速在80～240 r/min范圍內(nèi)的增加，抑菌圈直徑逐漸增加，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)速提高了發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量，為菌體生命活動(dòng)提供了充足的氧氣；當(dāng)轉(zhuǎn)速為240 r/min時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為14.9 mm；當(dāng)轉(zhuǎn)速＞240 r/min，抑菌圈直徑迅速減小，其原因可能是，過高的轉(zhuǎn)速影響了菌體的正常生長及生命活動(dòng)，從而導(dǎo)致發(fā)酵液中拮抗物質(zhì)逐漸減少。因此，確定最佳轉(zhuǎn)速為240 r/min。

由圖5e可知，隨著發(fā)酵溫度在25～30 ℃范圍內(nèi)的增加，抑菌圈直徑逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為15.0 mm；當(dāng)發(fā)酵溫度＞30 ℃，抑菌圈直徑逐漸降低。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

3 結(jié)論

本研究以抗尖孢鐮刀菌貝萊斯芽孢桿菌P9為試驗(yàn)菌株，其發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌的抑菌效果為考察指標(biāo)，對菌株P(guān)9的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。確定其產(chǎn)拮抗物質(zhì)最適的發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉6.8 g/L、酵母浸粉18.1 g/L、MnCl20.89 g/L、FeCl20.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L,K2HPO41.4 g/L,KH2PO40.6 g/L，pH 7.0；最佳發(fā)酵條件如下：接種量為4.5%，發(fā)酵溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速240 r/min，發(fā)酵時(shí)間72 h。在此優(yōu)化條件下，抑菌圈直徑可達(dá)到15.0 mm左右，比初始抑菌圈直徑（9.0 mm）擴(kuò)大了1.7倍，為尖孢鐮刀菌的生物防治提供理論基礎(chǔ)。