響應面法優化粘質沙雷氏菌產靈菌紅素發酵工藝

何鎮權，李 靜，鄧毛程，張遠平，王 瑤，楊 姬，蘇佳豪，漆祖粵，鐘海婷

（廣東輕工職業技術學院 食品與生物技術學院，廣東 廣州 510300）

靈菌紅素是一種來源于微生物的次級代謝產物，是具有三個吡咯環為骨架結構的紅色素[1]，靈菌紅素具有抗菌、抗瘧、抗腫瘤等作用，可誘導T、B淋巴細胞凋亡，引起了醫學、制藥和不同行業研究人員的興趣[2-3]，已從多個角度對靈菌紅素及其合成菌的特性進行深入研究，如對病原微生物的抑菌活性、合成菌的細胞運動、產物轉錄合成調控等[4-5]，尤其在誘導癌細胞凋亡方面具有特殊作用機制，被認為是一種具有巨大開發潛力的抗癌藥物[6-7]。

靈菌紅素最早發現由粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）產生，近年來也有產自鏈霉菌屬（Streptomyces）、弧菌屬（Vibrio）、惡臭單胞菌（Pseudomonas putida）的報道，至今人們普遍利用粘質沙雷氏菌進行靈菌紅素生物合成的研究[8-10]。劉思航等[11]通過正交試驗法優化粘質沙雷氏菌的發酵培養基和發酵條件，使靈菌紅素產量提高了2.845倍；洪偉等[12]通過響應面法對粘質沙雷氏菌發酵的甘油添加量、胰蛋白胨、搖床轉速等因素進行優化，使靈菌紅素產量較初始狀態提高了24倍。靈菌紅素是微生物的次級代謝產物[6]，培養基的磷酸鹽用量往往會影響次級代謝產物的生物合成。本研究在靈菌紅素高產菌種篩選的前期研究基礎上，通過響應面法對培養基磷酸鹽用量、溶氧量、發酵時間等因素進行優化，期望能夠提高粘質沙雷氏菌的靈菌紅素發酵水平，為相關研究及生產實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）PG12：現保藏于廣東輕工職業技術學院微生物實驗室；大豆油：中糧福臨門食品營銷有限公司；靈菌紅素標準品（純度＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；K2HPO4、MgSO4·7H2O（均為分析純）：天津永大化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2 培養基

種子培養基：葡萄糖32 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏8 g/L，K2HPO430 mmol/L，MgSO4·7H2O 0.45 g/L，調節pH值為7.0，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：大豆油30 g/L，蛋白胨12 g/L，K2HPO420～45 mmol/L，MgSO4·7H2O 0.45 g/L，調節pH值為7.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ZHWY-C2112F雙層恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；GJS-30D型全自動發酵罐：江蘇省鎮江貝利生物工程有限公司；RE-52A型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；TL-1000CT型超聲波細胞破碎儀：江蘇恒敏儀器制造有限公司；H1850R型高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；U-T6型紫外可見分光光度計：屹譜儀器制造（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粘質沙雷氏菌活化及種子液制備

將粘質沙雷氏菌PG12的斜面菌種接入200 mL種子培養基，于26 ℃、200 r/min的振蕩生化培養箱中培養10 h。將200 mL種子培養液接入20 L發酵培養基，按單因素試驗和響應面試驗的方案進行發酵。

1.3.2 菌株產靈菌紅素發酵工藝條件優化單因素試驗

（1）K2HPO4濃度對靈菌紅素產量影響

將發酵培養基中K2HPO4濃度分別調節為20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L、35 mmol/L、40 mmol/L、45 mmol/L，在發酵溫度26 ℃、pH7.5、溶氧量60%的條件下發酵36 h，檢測靈菌紅素產量。

（2）溶氧量對靈菌紅素產量影響

將發酵培養基中K2HPO4濃度調節為30 mmol/L，控制發酵溫度26 ℃和pH7.5，分別控制溶氧量為15%、30%、45%、60%、75%，發酵36 h，檢測靈菌紅素產量。

（3）發酵時間對靈菌紅素產量影響

將發酵培養基中K2HPO4濃度調節為30 mmol/L，控制發酵溫度26 ℃、pH7.5、溶氧量60%，分別發酵18 h、24 h、30 h、36 h，檢測靈菌紅素產量。

1.3.3 發酵工藝條件優化響應面試驗

在上述單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理[13-14]，選擇K2HPO4濃度（X1）、溶氧量（X2）、發酵時間（X3）為自變量，以靈菌紅素產量（y）為響應值，通過3因素3水平的響應面分析設計，對粘質沙雷氏菌PG12發酵產靈菌紅素條件進行優化，試驗因素水平設計見表1。

表1 菌株PG12產靈菌紅素發酵工藝條件優化響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process conditions optimization for prodigiosin production by strain PG12

1.3.4 靈菌紅素含量測定

配制一系列濃度的靈菌紅素標準溶液，在波長535 nm處測定吸光度值[15]，建立靈菌紅素標準曲線回歸方程（y=0.195 6x+0.005 3，R2=0.998 6）。參照文獻所述的靈菌紅素提取方法，取100 mL發酵液，利用超聲波細胞破碎儀在功率150 W條件下進行超聲波破碎處理15 min，在50 ℃下減壓蒸發去除水分，加入適量的、pH 3.0的甲醇，使色素溶解，經離心分離（15 000 r/min，20 min），獲得上清液，放入100 mL容量瓶，用pH 3.0的甲醇定容[16]。將色素溶液進行適當稀釋，在535 nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線回歸方程計算靈菌紅素含量。

1.3.5 數據處理與分析

利用Excel 2019和Design Expert 8.0響應面軟件進行統計分析及差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 K2HPO4濃度對發酵產靈菌紅素的影響

K2HPO4濃度對粘質沙雷氏菌PG12生物合成靈菌紅素的影響如圖1所示，當K2HPO4濃度為20～30 mmol/L時，靈菌紅素產量隨K2HPO4濃度增大而顯著增大；當K2HPO4濃度＞30 mmol/L時，靈菌紅素產量反而下降。在菌體生長階段，在一定濃度范圍內適當提高磷酸鹽濃度，可促進菌體生長，但隨著磷酸鹽被消耗，在次級代謝產物合成階段的磷酸鹽濃度通常要求不高于10 mmol/L[17-19]，否則會抑制次級代謝產物的合成。因此，根據接種量、發酵周期等具體情況，兼顧菌體生長和次級代謝對磷酸鹽的需求，在高于10 mmol/L的范圍內選擇合適的磷酸鹽濃度。在本試驗條件下，靈菌紅素產量在K2HPO4濃度為30 mmol/L時達到峰值1 446.4 mg/L。故選擇最適K2HPO4濃度為30 mmol/L。

圖1 K2HPO4濃度對菌株PG12產靈菌紅素的影響Fig.1 Effect of K2HPO4 concentration on prodigiosin production by strain PG12

2.1.2 溶氧量對發酵產靈菌紅素的影響

溶氧量對粘質沙雷氏菌PG12生物合成靈菌紅素的影響如圖2所示，溶氧量為15%～45%時，靈菌紅素產量隨溶氧量增大而增大；當溶氧量＞45%時，繼續增大溶氧量，靈菌紅素產量呈下降趨勢。文獻研究表明，靈菌紅素發酵液保持較高溶氧量水平可促進粘質沙雷氏菌生長和靈菌紅素合成[20]，發酵后期的耗氧量比發酵前期的耗氧量要小[21]。在本試驗條件下，靈菌紅素產量在溶氧量為45%時，達到峰值1549.1mg/L。故選擇最適溶氧量為45%。

圖2 溶氧量對菌株PG12產靈菌紅素的影響Fig.2 Effect of dissolved oxygen on prodigiosin production by strain PG12

2.1.3 發酵時間對發酵產靈菌紅素的影響

發酵時間對粘質沙雷氏菌PG12生物合成靈菌紅素的影響如圖3所示，在發酵時間18～30 h范圍內，靈菌紅素產量隨發酵時間延長而增大；當發酵時間超過30 h，繼續延長發酵時間，靈菌紅素產量呈下降趨勢。次級代謝產物的大量合成時間是在菌體停止生長之后，接種量、磷酸鹽濃度等因素的大小往往導致最佳的發酵時間不同[16，22-24]。在本試驗條件下，靈菌紅素產量在發酵時間為30 h達到峰值1 577.6 mg/L。故選擇最適發酵時間為30 h。

圖3 發酵時間對菌株PG12產靈菌紅素的影響Fig.3 Effect of fermentation time on prodigiosin production by strain PG12

2.2 響應面試驗分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

響應面試驗結果見表2。根據相關文獻方法，利用Design Expert 8.0軟件對試驗結果進行統計分析[25-26]，建立靈菌紅素產量（Y）關于K2HPO4濃度（X1）、溶氧量（X2）和發酵時間（X3）的二次多項回歸方程為：

表2 菌株PG12產靈菌紅素發酵工藝條件優化Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization for prodigiosin production by strain PG12

對該回歸模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著，而失擬項P為0.073 7，大于0.05，表明不顯著，因而該模型成立。模型的決定系數R2和校正決定系數R2（Adj）分別為0.997 4和0.994 1，兩者接近，說明模型的準確性較高。變異系數（coefficient of variation，CV）為2.37%，小于10%，表明試驗具有較高的可信度和精確度，模型與試驗擬合程度良好，可用該模型來預測靈菌紅素的最佳發酵工藝條件。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續表

由P值可知，一次項X1、X2、交互項X1X2、二次項X12、X22、X32對靈菌紅素產量有極顯著影響（P＜0.01），一次項X3對靈菌紅素產量有顯著影響（P＜0.05）其他項對靈菌紅素產量影響不顯著（P＞0.05）。F值可知，各因素對靈菌紅素產量的影響程度依次是：K2HPO4濃度（X1）＞溶氧量（X2）＞發酵時間（X3）。

2.2.2 響應曲面圖分析

各因素交互作用對靈菌紅素產量影響的響應曲面及等高線如圖4所示，從3D的曲面圖可以看出，K2HPO4濃度與溶氧量交互作用的曲面圖坡度最陡峭，表明交互作用最強；而溶氧量與發酵時間交互作用的曲面圖坡度最平緩，表明交互作用最弱。綜合幾個等高線分析來看，靈菌紅素產量＜1 400 mg/L時，等高線較密；當靈菌紅素產量≥1 400 mg/L時，對應的各因素數值大約集中表現為：K2HPO4濃度25.2～31.9 mmol/L，溶氧量＞33.5%。

圖4 各因素間交互作用對靈菌紅素產量影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the yield of prodigiosin

2.2.3 回歸模型的驗證

利用Design Expert 8.0軟件求取二次曲面方程的極值，得到粘質沙雷氏菌PG12產靈菌紅素的最佳發酵工藝條件為K2HPO4濃度28.45 mmol/L，溶氧量46.87%，發酵時間29.07 h，此條件下靈菌紅素產量預測值為1 639.76 mg/L。考慮到實際操作的可行性，將優化的發酵工藝條件修正為K2HPO4濃度28.45 mmol/L，溶氧量47%，發酵時間29 h。在此發酵工藝條件下進行3次平行試驗，靈菌紅素產量實際值為（1 636.5±13.7）mg/L，與預測值接近，故該回歸模型可用于優化粘質沙雷氏菌PG12的靈菌紅素發酵條件。相對于原始條件（K2HPO4濃度30 mmol/L、溶氧量60%、發酵時間36 h）下的靈菌紅素產量，優化條件下的靈菌紅素產量提高了13.14%。

3 結論

通過單因素試驗，篩選出K2HPO4濃度、溶氧量和發酵時間3種因素對靈菌紅素發酵產量有較大影響。采用Box-Behnken響應面法確定最佳的發酵工藝條件為K2HPO4濃度28.45 mmol/L，溶氧量47%，發酵時間29 h。在優化條件下，靈菌紅素產量達到1 636.5 mg/L，較原始條件下的靈菌紅素產量提高了13.14%，表明響應面法優化工藝可行性良好，可以為靈菌紅素發酵工藝條件控制的研究及生產實踐提供參考。