氣相色譜質譜聯用法測定封窖泥中的兩種土霉味物質

黃 箭，謝正敏，施 思，魏金萍，張 倩，范 濤，薛潤萍

（宜賓五糧液股份有限公司 中國輕工業濃香型白酒固態發酵重點實驗室，四川 宜賓 644000）

白酒是世界著名的六大蒸餾酒之一，其中濃香型白酒占據重要地位，其產量及市場占有率占整個白酒行業的70%左右[1-2]。眾所周知，濃香型白酒工藝是采用泥窖固態發酵[3]，其中封窖是濃香型白酒釀造生產中的重要工藝之一。封窖泥的質量是封窖工藝的關鍵，其質量的好壞，一方面決定了窖池封閉的嚴密性及是否染菌，另一方面直接影響到面糟酒的質量[4-5]。在長達60～80 d的發酵過程中[6]，由于封窖泥敞露于窖池外，泥質容易干裂引起窖池出現裂痕污染雜菌，另外，封窖泥營養成分的不斷減少，窖泥香味較差，容易產生糠臭味，影響面糟酒的質量。白酒的異味是相對于白酒的香味而言，具體地說，是指白酒產生不協調、偏離本品固有的香、味、風格的異味或雜味。白酒中常見的異味有澀味、苦味、泥臭味、酸味、糠味等[7-8]。隨著科技和社會的發展，越來越多的學者的研究表明，土臭素（geosmin，GSM）和2-甲基異茨醇（2-methylisoborneol，2-MIB）為引起白酒糠嗅味的主要物質[9-11]。

常見的“土霉味”物質有土臭素、二甲基異茨醇等，由于其閾值較低，即使在很低的濃度也會有明顯的土腥臭味，是造成水、魚肉以及紅酒中霉味或土味的主要原因[12-14]。盡管其在酒體中的含量較低，但人的嗅覺對其極其敏感，有研究表明[15]，2-MIB嗅覺閾值約為5～10 ng/L，GSM嗅覺閾值約為1～10 ng/L，超過此閾值會產生令人厭惡的土霉味。

目前，針對GSM和2-MIB的分析主要集中在水體中的檢測，前處理方法包括液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）[16]、攪拌棒吸附萃?。╯tir bar sorptive extraction，SBSE）[17]、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）[18]、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）[19-20]等，由于SPME前處理方法無需溶劑，檢出限低，靈敏度高，GSM和2-MIB的分析國標GB/T 32470—2016《生活飲用水臭味物質土臭素和2-甲基異莰醇檢驗方法》[21]采用SPME-氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法。針對其在酒行業中檢測主要前處理方法也是SPME法，是因為GSM和2-MIB在酒中含量較低，且揮發性較強。DU H等[22-23]通過氣相色譜-嗅聞（gas chromatography olfactometry，GC-O）結合GC-MS技術確定了中國白酒中糠味物質的化學本質為土臭素，通過追蹤白酒發酵過程以及制曲過程，認為土臭素是由大曲中微生物的新陳代謝而產生的，并由大曲參與發酵帶入原酒中；張燦[10]運用浸入式固相微萃?。╠irectimmersion-solid phase microextraction，DI-SPME）結合氣相色譜質譜聯用對不同香型的白酒進行檢測也發現了土臭素的存在。WEINGART G等[14]應用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜與質譜聯用（GC-MS）技術分析發現土味素和2,4,6-三氯苯甲醚在白葡萄酒和紅葡萄酒中均會造成軟木塞味、土霉味、霉臭味等異嗅。DARRIET P等[24]通過GC-O聞香技術結合GC-MS分析，也發現土臭素的含量超過其嗅覺閾值時會使葡萄汁和葡萄酒產生土霉味。由于土霉味在白酒中普遍存在，并對口感、香氣的影響比較嚴重，濃香型白酒在發酵過程中需定期對窖泥進行養護，在養護過程中常在封窖泥表面發現長霉及伴隨土腥臭味的現象，這些氣味極可能會隨著面糟酒的蒸餾而引入白酒，導致白酒品質變差。因此，本研究建立頂空固相微萃?。℉S-SPME）結合氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）分析封窖泥中的痕量2-MIB和GSM方法，旨在確定白酒中異味物質的來源及控制其含量提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GSM標準溶液（100 mg/L）、2-MIB標準溶液（100 mg/L）：美國Supelco公司；NaCl、乙醇、甲醇（均為色譜純）：德國Merck公司；SPME萃取纖維頭：50/30 μm二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）、75 μm Carboxen/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）、100 μm PDMS：美國Supelco公司。

1.2 儀器與設備

Agilent7890A-5975C氣相色譜質譜聯用儀：安捷倫科技有限公司；GERSTEL多功能全自動樣品前處理平臺MPS2：德國GERSTEL公司；Milli-Q純水機：密理博有限公司；Centrifuge 5810R離心機：德國艾本德有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

在封窖泥上均勻選取5個點，取樣深度大概3～5 cm左右，每個點取20 g左右窖泥，混勻窖泥后碾碎（避免均一性較差），待測。

常壓蒸餾萃?。簻蚀_稱取5.0 g混勻后的窖泥于250 mL蒸餾瓶中，加入75 mL 10%（V/V）乙醇水溶液作為溶劑，常壓蒸餾，收集餾分15 mL為封窖泥提取液，冷藏待測。

超聲波提?。簻蚀_稱取2.0 g混勻后的窖泥于50 mL離心管中，加入10 mL 50%（V/V）乙醇水溶液，渦旋均勻，超聲15 min（超聲功率360 W、超聲頻率40 kHZ、超聲溫度25 ℃），8 000 r/min離心5 min，倒出上清液，重復以上步驟一次合并提取液待測。

1.3.2 超聲波提取條件優化

提取溶劑的選擇：取2 g封窖泥置于50 mL離心管中，分別加入體積分數為10%、30%、50%、100%乙醇水溶液10 mL作為溶劑，渦旋均勻后超聲提取15min，再次渦旋振蕩1 min，8 000 r/min離心5 min，上清液為封窖泥提取液，冷藏待測。

提取次數的選擇：重復以上步驟3次，分別測的每次的提取結果，根據提取效率決定提取次數。

1.3.3 頂空固相微萃取條件的優化

分別考察不同類型萃取頭（50/30μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS），萃取時間（30 min、40 min、50 min、60 min、70 min），萃取溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃），提取溶劑（純水、體積分數5%、10%、20%、40%的乙醇）對目標組分的萃取效率。

1.3.4 標準溶液的配制及標準曲線的建立

混合標準溶液的配制：分別吸取質量濃度均為100 mg/L的GSM和2-MIB標準溶液0.1 mL，用甲醇配制成10 mg/L的混合標準溶液；吸取混合標準溶液1 mL，用甲醇配制成質量濃度為0.1 mg/L的混合標準使用液，4 ℃冷藏待用。

頂空固相微萃取標準曲線的建立：吸取含有0.1 mg/L的GSM和2-MIB混合標準使用液，用體積分數為5%乙醇分別配制成10 ng/L、50 ng/L、100 ng/L、200 ng/L、400 ng/L、800 ng/L、1 500 ng/L的系列標準溶液。在優化的頂空固相微萃取的條件下，加入1.5 g NaCl，渦旋均勻后進行SPMEGC-MS的富集和測定。以待測物的質量濃度（X）為橫坐標，對應的定量離子色譜峰面積（Y）為縱坐標建立標準曲線。

直接進樣標準曲線的建立：吸取含有0.1 mg/L的GSM和2-MIB混合標準使用液，用甲醇逐級稀釋配制成1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L的系列標準溶液，在優化質譜條件下進行測定。以待測物的質量濃度（X）為橫坐標，對應的定量離子色譜峰面積（Y）為縱坐標建立標準曲線。

1.3.5 HS-SPME-GC-MS分析檢測條件

頂空固相萃取條件：熱平衡5 min，萃取溫度50 ℃，萃取時間50 min，然后250 ℃下解吸5 min；取0.5 mL封窖泥提取液于20 mL頂空瓶中，加入4.5 mL超純水，1.5 g NaCl，渦旋均勻后插入裝有65 μm PDMS/DVB固相微萃取自動進樣器對封窖泥提取液進行萃取，用于GC-MS分析。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管柱（30 m×250 μm×0.25μm）；載氣為氦氣（He）（純度＞99.999%），流速1 mL/min；進樣方式：不分流進樣；柱溫為起始溫度60 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至200 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至280 ℃，保持2 min；進樣口溫度250 ℃；輔助加熱溫度280 ℃。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，溶劑延遲5 min，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃。采集模式為選擇離子監測（selected ion monitoring，SIM）模式，在SIM模式下對標準工作溶液及待測液進行分析。

定性定量方法：根據保留時間和定性離子進行定性，所得的質譜圖與美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology,NIST）20比較，外標法定量。GSM定量離子112 m/z，定性離子125 m/z，182 m/z；2-MIB定量離子95 m/z，定性離子108 m/z，135 m/z。

2 結果分析

2.1 GSM和2-MIB的測定

封窖泥經超聲波提取后，進行GC-MS分析，所得的質譜圖與NIST 20比較，其中GSM與數據庫的匹配度能達到94%，2-MIB的質譜碎片離子與譜庫的匹配度達到91%。在相同條件下，對比了向封窖泥中添加標準混合物，通過GC-MS檢測，比較添加前后的總離子流色譜圖，見圖1。由圖1可知，可見未加標和加標GSM和2-MIB保留時間一致，可以確定該物質為GSM和2-MIB。

圖1 封窖泥中添加標準混合物前后土臭素和二甲基異茨醇的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of geosmin and 2-methylisoborneol in pit-sealing mud before and after addition of standard mixture analyzed by GC-MS

2.2 提取條件的對比

2.2.1 提取方法的選擇

分別對比了常壓蒸餾萃取和超聲波提取兩種方式對封窖泥中GSM和2-MIB的提取效果，結果見圖2。由圖2可知，超聲波提取法的回收率和常壓蒸餾法萃取回收率相差不大，均達到了90%左右。李煒等[25]以純水為提取溶劑對比了常壓蒸餾萃取和超聲波提取大曲中的GSM，結果表明，常壓蒸餾的回收率更高，分析其原因可能是由于GSM在純水中的溶解性較低，本法將提取溶劑純水改為了不同體積分數的乙醇，超聲波提取效率顯著提高，相較于常壓蒸餾，超聲波提取方法更加簡單，高效，適用于大量樣品的檢測，而常壓蒸餾操作步驟較為繁瑣。為了操作簡便，節約時間，因此，選擇超聲波提取封窖泥中的GSM和2-MIB。

圖2 不同提取方式對封窖泥中土臭素和二甲基異茨醇的提取效果比較Fig.2 Comparison of the extraction effect of different extraction methods on the geosmin and 2-methylisoborneol in pit-sealing mud

2.2.2 不同體積分數的乙醇對提取效率的影響

實驗分別考察了用10 mL體積分數為10%、30%、50%、100%的乙醇水溶液對封窖泥中的GSM和2-MIB的提取效果，結果見圖3。

圖3 不同體積分數的乙醇對封窖泥中土臭素和二甲基異茨醇的提取效果比較Fig.3 Comparison of the extraction effect of different volume fractions ethanol on the geosmin and 2-methylisoborneol in pit-sealing mud

由圖3可知，體積分數為50%和100%的乙醇水溶液在第1次提取時，回收率便已達到90%左右，繼續重復提取第2次、第3次的回收率已很低，故最終選取了提取兩次，共20 mL提取溶劑；而體積分數為10%和30%的第一次的回收率只有60%左右，據文獻表明，GSM和2-MIB為弱極性物質，其在乙醇中的溶解性遠高于水中，隨著乙醇含量的升高，回收率越來越好，但是由于高含量的乙醇會對固相微萃取的纖維頭形成競爭吸附[25]。因此，選擇體積分數為50%乙醇水溶液作為提取溶劑，提取溶劑的體積為20 mL，提取次數為2次。

2.3 頂空固相微萃取條件的優化

2.3.1 不同HS-SPME萃取頭的選擇

分別對比不同萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS）的萃取效率，結果見圖4。由圖4可知，65 μm PDMS/CAR萃取頭萃取效率明顯高于其他萃取頭。因此，選擇最適萃取頭為65 μm PDMS/DVB。

圖4 不同萃取頭對封窖泥中土臭素和二甲基異茨醇萃取效率的影響Fig.4 Effect of different extraction heads on the extraction efficiency of geosmin and 2-methylisoborneol in pit-sealing mud

2.3.2 萃取時間的選擇

考察不同萃取時間（30 min、40 min、50 min、60 min、70 min）對65 μm PDMS/DVB萃取GSM和2-MIB效率的影響，結果見圖5。由圖5可知，隨著萃取時間的增加，目標物的色譜峰面積也隨著顯著增加，在50 min時萃取達到平衡，萃取得到的峰面積最大，隨著萃取時間繼續增加，目標物組分色譜峰的面積增加不大。因此，選擇最適萃取時間為50min。

圖5 不同萃取時間對封窖泥中土臭素和二甲基異茨醇萃取效率的影響Fig.5 Effect of different extraction time on the extraction efficiency of geosmin and 2-methylisoborneol in pit-sealing mud

2.3.3 萃取溫度的選擇

考察不同萃取溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）對目標組分的萃取效率，結果見圖6。由圖6可知，隨著萃取溫度的增高，目標組分的峰面積逐漸增大，當萃取溫度達到50 ℃時，2-MIB的峰面積達到最大，萃取溫度達到60 ℃時，GSM的峰面積達到最大，隨著萃取溫度的繼續增加，峰面積呈明顯的下降趨勢，可能是較高溫度迫使水蒸汽附著在萃取頭上，影響了目標組分與萃取頭的進一步結合。因此，選擇最適萃取溫度為50 ℃。

圖6 不同萃取溫度對封窖泥中土臭素和二甲基異茨醇萃取效率的影響Fig.6 Effect of different extraction temperature on the extraction efficiency of geosmin and 2-methylisoborneol in pit-sealing mud

2.3.4 不同體積分數的萃取溶劑對萃取效率的影響

由于封窖泥的循環使用，使得其成分復雜，富含有機質，并逐漸有了窖泥的芳香味。在對封窖泥中GSM和2-MIB的提取過程中，某些揮發性物質（如有機酸）也會被提取出來，和GSM和2-MIB形成競爭吸附，影響了SPME的萃取效率。考慮到GSM和2-MIB用固相微萃取具有較低的檢出限，故將提取液通過稀釋后降低其他成分對待測組分的干擾，分布考察純水、體積分數5%、10%、20%、40%的乙醇富集效率，結果見圖7。

圖7 不同體積分數的溶劑對封窖泥中土臭素和二甲基異茨醇萃取效率的影響Fig.7 Effect of different volume fraction solvents on the extraction efficiency of GSM and 2-MIB in pit-sealing mud

由圖7可知，隨著乙醇體積分數的增加，SPME的富集效率在逐漸降低，這可能是因為乙醇和待測組分之間存在著競爭吸附，從而影響了GSM和2-MIB的富集效果。由于樣品經超聲波提取或常壓蒸餾后的餾分乙醇體積分數為50%左右，將其稀釋10倍不但可以提高GSM和2-MIB的萃取效率，還可以降低封窖泥中其他復雜成分對待測組分的干擾。因此，選擇最適提取溶劑為體積分數5%乙醇。

2.4 HS-SPME和直接進樣條件下檢測方法的線性關系及檢出限

在優化的頂空固相微萃取條件下，對系列標準溶液進行了SPME-GC-MS和直接進樣兩種方式的富集和檢測，以標準溶液的質量濃度（X）為橫坐標，待測物定量離子的峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。以定量離子信噪比S/N=3對應濃度為檢出限（limit of detection，LOD），S/N=10為定量限（limit of quantitation，LOQ）。由表1可知，SPME-GC-MS在10～1500ng/L范圍內線性良好，相關系數R2≥0.997。在優化的GC-MS條件下，對系列標準溶液進行直接進樣測定，在1000～40 000 ng/L的范圍內線性關系良好，相關系數R2≥0.998。

表1 HS-SPME和直接進樣條件下的線性回歸方程、相關系數、檢出限、定量限Table 1 Linear equation,correlation coefficient,limits of detection,and limits of quantitation under HS-SPME and direct injection conditions

2.5 HS-SPME和直接進樣兩種條件下檢測方法的加標回收率及精密度試驗

取經粉碎混勻的封窖泥18份，平均分為三組，各組分別添加不同量的GSM和2-MIB標準混合溶液，在3個濃度的添加水平上，每個樣品重復6次測定，HS-SPME和直接進樣條件下加標回收率及精密度試驗結果見表2。由表2可知，HSSPME條件下測定GSM和2-MIB的平均回收率在78.47%～106.75%之間，精密度試驗結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為4.3%～12.9%。直接進樣條件下測定GSM和2-MIB的平均回收率在83.25～110.24%之間，精密度試驗結果相對標準偏差為3.9%～9.4%。結果表明，該檢測方法準確度和精密度良好。

表2 HS-SPME和直接進樣條件下加標回收率及精密度試驗結果Table 3 Results of standard recovery rate and precision tests under HS-SPME and direct injection conditions

2.6 實際樣品的測定

分別采用HS-SPME和直接進樣兩種條件下對生產車間的20個封窖泥樣品（編號為Y1～Y20）中的GSM和2-MIB進行檢測，結果見表3。

表3 封窖泥樣品中土臭素和二甲基異茨醇測定結果Table 3 Determination results of geosmin and 2-methylisoborneol in pit-sealing mud μg/kg

續表

續表

由表3可知，20個樣均有GSM的檢出，范圍為2.40～63.06 μg/kg，65%的樣品GSM的檢出含量＜10 μg/kg，2-MIB的檢出率較低，只有20%的樣品被檢出，范圍為0.8～1.5μg/kg。

針對GSM兩種進樣模式的結果偏差在20%以內，而直接進樣中未檢出2-MIB，原因是2-MIB的含量較低。兩種檢測模式各有優缺點，直接進樣適用于高含量的樣品分析，因為直接進樣的檢出限不及HS-SPME，痕量樣品的分析采用直接進樣容易出現干擾，導致定性離子比值不對，易出現假陽性的檢測結果。HS-SPME比直接進樣具有更低的檢出限，適用于痕量（＜3 μg/kg）樣品的分析，但HS-SPME較直接進樣費時，同時萃取頭昂貴。因此，在面對樣品的檢測時，應根據樣品中待測物含量選擇更加適合的檢測模式。

3 結論

本研究建立了超聲波提取結合HS-SPME-GC-MS法測定封窖泥中的GSM和2-MIB的方法，確定了超聲波提取的最佳條件為：10 mL體積分數為50%的乙醇提取兩次；HS-SPME萃取條件為：采用65 μm PDMS/DVB，萃取溫度50 ℃，NaCl添加量為0.3 g/mL，萃取時間為50 min，平衡時間為5 min。比較了HS-SPME和直接進樣兩種模式的檢測結果的差異，結果表明，在針對超痕量樣品的檢測，HS-SPME較直接進樣更有優勢，對高含量樣品的檢測，選擇直接進樣模式更加簡便，經濟。實際的檢測工作中應根據樣品中待測物的含量選擇合適的檢測方法，兩種模式下方法的線性關系均良好，相關系數R2≥0.997，加標回收率在78.47%～110.24%之間。該方法的建立為酒類企業對封窖泥中的GSM和2-MIB提供了一種簡便、靈敏的檢測手段，對提高酒體質量，防止白酒生產中的異味產生具有重要意義。