SRSF6和miR-506-3p在結核性胸膜炎胸腔積液中表達的意義及其診斷價值

梁亞充 王國衛 馬麗 池躍朋 王智慧 謝蘭品 董雅坤 李曉倩

結核性胸膜炎是由于結核分枝桿菌及其代謝產物入侵胸腔侵犯胸膜引發的一種炎癥反應[1-2]，胸腔積液是滲出性胸膜炎主要表現[3]。結核性胸膜炎起病較為隱匿，臨床容易出現漏診誤診，因此尋找特異性的診斷指標意義重大。富含絲氨酸/精氨酸剪接因子(Serine/arginine-rich splicingfactor，SRSF)家族已被證實在多種癌癥中呈現出異常表達[4]。研究表明，SRSF6在結核性胸腔積液中表達異常升高，敲低SRSF6能夠抑制炎癥刺激的胸膜間皮細胞的細胞增殖[5]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)參與多種疾病的病理生理過程。Liang[5]等人研究發現，結核性胸腔積液外泌體miR-506-3p表達水平降低，同時抑制miR-506-3p能夠促進SRSF6的表達。基于此，本研究對結核性胸膜炎胸腔積液中SRSF6、miR-506-3p進行檢測，以探討兩者對結核性胸膜炎的診斷價值。

資料與方法

一、一般資料

選取2020年1月到2022年1月本院收治的60例結核性胸膜炎胸腔積液患者作為結核組，患者均通過胸腔積液的常規檢查及胸膜活檢確診。納入標準：符合《肺結核診斷WS288—2017》中結核性胸膜炎相關診斷標準[6]：①胸腔積液為滲出液，胸腔積液或胸膜組織活檢顯示結核分枝桿菌陽性；②胸膜組織活檢顯示典型的結核性病理改變。以上兩條滿足其中一條即可確診。另選取同期非結核性胸膜炎胸腔積液患者30例作為對照組。排除標準：①其它原因如惡性腫瘤、肺癌等導致的惡性胸腔積液患者；②免疫性疾病導致的胸腔積液患者；③不接受穿刺患者；④近三個月內有胸部手術史患者；⑤精神異常無法配合患者。兩組患者對本研究知情并簽署知情同意書。本研究經醫院倫理委員會批準，倫理批號：2019-M172。

二、方法

1 臨床資料收集

收集患者入院時的基本資料，包括性別、年齡、體質量指數、飲酒史、吸煙史、臨床表現(發熱、胸痛、咳嗽、氣短)。患者住院后，經超聲定位引導，無菌條件下進行胸腔穿刺，收集胸腔積液，記錄胸腔積液體積，對胸腔積液進行常規檢查，包括腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase，ADA)、乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase，LDH)、γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)、淋巴細胞計數、總蛋白等。

2 樣品采集

兩組患者均于無菌條件下進行胸腔穿刺，抽取胸腔積液約20mL，置含肝素的離心管中，離心機3000r/min離心10min，取上清液，置-80℃冰箱保存待測。

3 主要儀器與試劑

TRIzol試劑(貨號：GMS12279)購自上海杰美基因醫藥科技有限公司；M-MLV反轉錄試劑盒(貨號：RE0510-100T)購自定州百克賽斯生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒(貨號：QPG-050～QPG-052)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；qRT-PCR儀(型號：CFX384)購自美國Bio-Rad公司；SRSF6 ELISA試劑盒(貨號：EH2136)購自武漢菲恩生物科技有限公司；SpectraMax iD5型酶標儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

4 qRT-PCR檢測胸腔積液上清液miR-506-3p的表達水平

使用TRIzol試劑提取胸腔積液上清液樣本中總RNA，反轉錄成cDNA(反轉錄反應體系：總RNA 2 μL、RNase Free dH2O(20 μL)、PrimeScript RT Master Mix(4 μL))后進行qRT-PCR反應，qRT-PCR檢測條件：95℃預變性5min循環1次，95℃變性30s、55℃退火45s，75℃延伸15秒，共循環35次。以U6為內源對照，以2-ΔΔCt的方法計算miR-506-3p的表達水平。引物由亞泰恒信生物科技(北京)有限公司合成(見表1)。

5 ELISA法檢測胸腔積液SRSF6表達水平

采用ELISA法檢測胸腔積液SRSF6水平，操作步驟按照ELISA試劑盒說明書進行。

三、統計學分析

表1 qRT-PCR引物序列

結 果

一、兩組臨床資料比較

兩組年齡、性別、體質量指數、胸腔積液體積、發熱、胸痛、咳嗽、氣短、飲酒史、吸煙史比較無顯著差異(P>0.05)；結核組ADA、LDH、IFN-γ、淋巴細胞計數、總蛋白均明顯高于對照組(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組臨床資料比較

二、兩組胸腔積液SRSF6、miR-506-3p表達水平比較

結核組胸腔積液SRSF6水平明顯高于對照組(P<0.05)，miR-506-3p明顯低于對照組(P<0.05)(見表3)。

三、結核組胸腔積液SRSF6與miR-506-3p表達水平的相關性分析

TargetScanHuman網址預測SRSF6與miR-506-3p間存在結合位點(見圖1)。Pearson相關性分析結果顯示，結核組患者胸腔積液SRSF6與miR-506-3p表達水平呈負相關(r=-0.554，P<0.05)(見圖2)。

四、多因素Logistic回歸分析影響結核性胸膜炎發生的因素

以發生結核性胸膜炎為因變量(是=1，否=0)，ADA(≥47.57U/L=1，<47.57U/L=0)、LDH(≥361.84U/L=1，<361.84U/L=0)、IFN-γ(≥182.35ng/L=1，<182.35ng/L=0)、淋巴細胞計數(≥5.10×109/L=1，<5.10×109/L=0)、總蛋白(≥43.31g/L=1，<43.31g/L=0)、SRSF6(≥1.57ng/mL=1，<1.57ng/mL=0)、miR-506-3p(<0.75=1，≥0.75=0)為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，SRSF6高水平(≥1.57ng/mL)、miR-506-3p低水平(<0.75)是影響結核性胸膜炎發生的危險因素(P<0.05)(見表4)。

圖1 SRSF6與miR-506-3p結合位點

表3 兩組胸腔積液SRSF6、miR-506-3p表達水平比較

圖2 結核組患者胸腔積液SRSF6與miR-506-3p相關性

五、胸腔積液SRSF6、miR-506-3p表達水平對結核性胸膜炎的診斷價值分析

ROC曲線顯示，SRSF6單獨診斷結核性胸膜炎的AUC為0.890(95%CI:0.823～0.957)，其敏感度、特異性分別為81.7%、90.0%，截斷值為1.205ng/mL；miR-506-3p單獨診斷結核性胸膜炎的AUC為0.870(95%CI:0.792～0.949)，其敏感度、特異性分別為76.7%、80.0%，截斷值為0.889；兩者聯合診斷結核性胸膜炎的AUC為0.967(95%CI:0.937～0.996)，其敏感度、特異性分別為85.0%、71.6%，兩者聯合診斷的AUC顯著大于SRSF6單獨診斷的AUC(Z=2.072，P=0.038)，miR-506-3p單獨診斷的AUC(Z=2.271，P=0.023)(見圖3)。

表4 多因素Logistics回歸分析影響結核性胸膜炎發生的因素

圖3 胸腔積液SRSF6、miR-506-3p診斷結核性胸膜炎的ROC曲線

討 論

結核病是一種全球性的傳染性疾病，中國的結核病負擔高居世界第二位[7]。結核性胸膜炎是肺外結核的一種類型，患者常伴有發熱、胸痛、咳嗽、氣短等不適，并出現不同程度的胸腔積液[8]。胸腔積液可由多種病因引起，如多種惡性腫瘤和一些良性炎癥性疾病[9]，而結核性胸膜炎引起的胸腔積液占30%～60%[10]。由于結核性胸膜炎胸腔積液中結核分枝桿菌數量較少，臨床檢查胸腔積液中結核分枝桿菌難度較大，難以滿足診斷要求[8]。目前對于結核性胸膜炎的診斷包含細菌學、分子生物學、病理學、免疫學等多個學科，ADA、LDH、γ干擾素釋放試驗及聚合酶鏈反應等發揮了重要作用[11]。不斷尋求新的生物標志物和治療靶點在結核性胸膜炎的治療中尤為重要。

SRSF家族主要參與基因的剪切調節，研究證實，SRSF家族參與多種疾病的進展[4,12-13]。人SRSF6基因位于第20號染色體上，至少包含7個外顯子和6個內含子[14]。SRSF6在急性淋巴細胞白血病[15]、結直腸癌[16]等多種疾病中均呈現出過表達的現象。本研究發現，結核組患者胸腔積液中SRSF6表達水平明顯升高，與其在淋巴細胞白血病[15]、結直腸癌[16]中的表達一致，在疾病進展過程中發揮促進作用。同時Han[17]等人研究發現，SRSF家族的其它三種剪接因子在結核性胸腔積液中也呈現出表達升高的現象。由此推測SRSF6能夠促進結核性胸膜炎的發生發展，可能與結核性胸膜炎的發病機制存在一定的關聯。miRNAs能夠與靶mRNA的3′-UTR結合從而調控基因的表達，參與多項生理過程。陽慧[18]等人發現，miR-506-3p能夠抑制心肌炎模型大鼠的炎性反應和心肌細胞凋亡。體外細胞實驗表明，miR-506-3p能夠通過靶向IQGAP1基因抑制甲狀腺癌細胞的增殖和遷移[19]。同時miR-506-3p也可接受lncRNA HOXA11-AS的靶向負調控，抑制食管癌細胞的增殖，誘導癌細胞凋亡[20]。本研究中，結核組患者胸腔積液中miR-506-3p表達水平明顯降低，表明與其在癌癥中的腫瘤抑制作用一樣，miR-506-3p對結核性胸膜炎同樣具有抑制作用。通過TargetScanHuman網站分析顯示，SRSF6與miR-506-3p存在靶向結合位點，表明SRSF6極有可能是miR-506-3p的靶基因。Pearson相關性分析結果顯示，結核組患者胸腔積液SRSF6與miR-506-3p表達水平呈負相關，提示miR-506-3p可能通過負向調控SRSF6參與結核性胸膜炎的發生發展。本研究中，在兩組患者入院后對其胸腔積液進行了生化檢查，發現結核組患者胸腔積液中ADA、LDH、IFN-γ、淋巴細胞計數、總蛋白均明顯高于對照組，但多因素Logistic回歸分析顯示，ADA、LDH、IFN-γ、淋巴細胞計數、總蛋白不是影響結核性胸膜炎發生的危險因素，可能是由于這些指標容易受到患者的年齡、淋巴細胞數量、結核分枝桿菌的細菌負荷等因素的影響，但依然可作為診斷的參考項目。多因素Logistic回歸分析顯示，SRSF6高水平、miR-506-3p低水平是影響結核性胸膜炎發生的危險因素，表明兩者在結核性胸膜炎的疾病進展中發揮著重要作用。同時ROC曲線顯示，胸腔積液SRSF6、miR-506-3p診斷結核性胸膜炎的AUC分別為0.890、0.870，兩者聯合診斷的AUC為0.967，且敏感度高于兩者單獨診斷。表明胸腔積液SRSF6、miR-506-3p對結核性胸膜炎有一定的診斷價值，且兩者聯合的診斷價值更高。

綜上所述，結核性胸膜炎患者胸腔積液SRSF6表達升高，miR-506-3p表達降低，兩者可能參與結核性胸膜炎的疾病進展過程，是影響結核性胸膜炎的危險因素，兩者聯合對結核性胸膜炎具有更高的診斷價值，有望成為早期診斷指標。但本研究納入病例數較少，同時并未深入探討兩者在結核性胸膜炎中的具體作用機制，因此后續仍需進行深入研究。