乳制品常見食源性致病菌檢測技術研究進展分析

文 劉艷麗 郭培培 張方方 河南花花牛乳工程研究院有限責任公司

乳制品是以鮮羊乳或牛乳為主要原料制成的各種食品。因其良好的口感與豐富的營養，在市場中擁有大量的受眾。但同時，也容易受到食源性致病菌的污染，進而誘發一些食品安全問題。所以，做好乳制品食源性致病菌的檢測，已成為保證乳制品相關食品安全的關鍵。鑒于此，文章綜述了檢測乳制品食源性致病菌的幾種常見技術。

得益于我國社會經濟的穩健、快速發展，進一步提高了民眾的物質生活水平，由此也明顯改善了民眾的膳食結構，更多人加大了對乳與乳制品的購買量。據有關統計數據顯示，在1996年-2006年，城鎮居民家庭鮮奶人均購買量增長數倍，由4.6kg增長到18.3kg，雖然從2007年開始購買量有所下滑，但購買量依舊較高。而與之相對的則是，乳和乳制品質量安全事件愈加頻發，使得人們越來越關注乳制品的安全問題。

乳制品擁有豐富的營養，能夠提供人體所需的維生素B2、維生素A、磷、鈣及蛋白質等。伴隨近些年人們生活質量的提升，普遍改善了國內家庭的膳食層次，由此也增大了對乳制品的需求。當前乳制品的種類主要有粉態乳、液態乳及其他種類的乳制品。正因乳制品含有豐富的營養，因此其受微生物污染的幾率較大。據相關調查顯示，誘發乳制品安全事件的關鍵因素，便是致病菌污染所導致的中毒。乳制品食源性致病菌種類較多，譬如沙門氏菌等，這些致病菌在自然界廣泛存在，能夠通過多種途徑給產品造成污染，導致產品變質，如加工人員、運輸過程等。尤其是奶粉中存在的食源性致病菌，容易給嬰幼兒造成感染，且有著較高的致死率。鑒于此，應用科學、正確的檢測方法至關重要。

1.基于培養的檢測技術

現如今，對于乳制品檢驗，國家明確了相關標準，如GB4789.40-2010《阪崎腸桿菌檢驗》，GB4789.10-2016《金黃色葡萄球菌檢驗》等。通常而言，同種微生物在相同培養時間、溫度與培養基下，菌落特征相對穩定，如菌落的形狀與顏色等，所以，通過對菌落形態特征地觀察，能夠有效判斷微生物的種類。通過基于細菌培養的檢測方式，均能從樣品內獲得致病菌定量與定性的檢驗結果，擁有準確度高、成本低等優點。但要經過樣品生化鑒定、分離、增菌、樣品處理等過程，暴露出操作復雜、周期長及能夠鑒定的微生物種類較少等缺陷，無法對市場需求做良好滿足。故此，一些擁有更佳特異性、能更快完成檢測的致病菌檢測技術陸續出現。

2.分子生物學檢測技術

分子生物學發展時間較久，近十多年來在食源性致病菌檢測方面，得到最廣泛應用的分子生物學技術，便是聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）。同時，基于常規PCR技術，又衍生出環介導等溫擴增技術、多重PCR等技術。

2.1 常規PCR技術

PCR擁有和DNA天然復制過程相似的原理，其特異性主要是依賴與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。通過對DNA雙鏈進行加熱促使其變性為單鏈DNA，然后將單鏈DNA作為模板，融入與模板DNA兩端正領近序列互補、2段人工合成的寡核苷酸片斷為引物，也就是下游與上游引物，此引物結合互補模板單鏈DNA堿基后，在DNA聚合酶、4種脫氧核糖苷酸存在的前提下，引物沿模板DNA鏈，朝5’→3’方向延伸，自動合成新的一條DNA鏈，合成的新DNA雙鏈，又能作為下次循環模板。能夠較快完成一個循環，通常為2-4min，目的基因經2-3h就可實現數百萬倍的擴增。例如沙門氏菌檢測技術的發展，Rahn等借助沙門氏菌的invA完成了一對引物的設計，對沙門氏菌首次借助PCR方法完成檢測，檢測結果顯示檢出沙門氏菌630株，檢出血清型上百種、非沙門氏菌142株、21個菌屬，達到了99.4%的檢出率。

2.2 環介導等溫擴增技術

該技術誕生于2000年，由Notomi開發所得，屬于新型的一種核酸擴增技術（LAMP）。其結合目的基因6個區域，完成4條引物地設計，于等溫條件下（60-65℃）經過DNA聚合酶的置換，實現了擴增目的基因的高效、快速擴增。袁耀武等，關于單核細胞增生李斯特式菌的檢測，便借助LAMP技術。實際操作中選FTA濾膜提取的細菌DNA為模板做擴增，完成了12株菌的檢測，檢測結果顯示具有7.3×101CFU/mL的靈敏度，無交叉反應，此方法特異性好、靈敏度高，且對于儀器無較高要求，尤其適用于經濟不發達地區或基層。

2.3 多重PCR技術

該技術是在同一反應體系加入2對及以上特異性引物，完成多個目的片段的擴增。其原理為在特異性引物、適當緩沖液、模板DNA及dNTP存在的情況下，借助DNA聚合酶催化，擴增多對特異性引物結合的DNA片段。因為在相同反應體系內，多重PCR能完成多個基因的檢測，有助于檢測成本及時間的節約，屬于經濟性良好、效率高的食源性致病菌檢測技術。有學者結合sdfl、spy、Hat、invA等沙門氏菌特異性基因建立了多重PCR方法，檢測不同血清型沙門氏菌，最終得出，全部沙門氏菌均完成對應目的片段的特異性擴增，檢測生肉中沙門氏菌時通過磁分離富集處理，靈敏度降至102CFU/g，使檢測時間與成本得以有效節約，保證了檢測效率。

2.4 核酸交聯染料結合PCR技術

關于乳制品致病菌的檢測，PCR技術存在一定缺陷，如無法完成死菌與活菌的有效區分，若依舊把提取的死菌DNA作為模板展開特異性擴增，可能會有假陽性的結果出現。為了良好檢測乳制品的食源性致病菌，保證食品安全和民眾身體健康，需要探索更具準確性且檢測更為迅速的活菌檢測技術。核酸交聯染料便是采用烷基化試劑，且試劑≥2個烷基化官能基團，含有苯醌吖啶、疊氮溴化丙錠（PMA）等，是能選擇性透過死菌的一類細胞膜，通過與DNA共價交聯，把死菌DNA擴增信號物質消除，借助PMA/EMA -PCR技術，可以避免死菌影響到PCR擴增，保證擴增信號僅源自活菌DNA，從而得到與國際方法一致的檢測結果。現如今，檢測致病菌時較常應用PMA和EMA。

有學者在檢測嬰幼兒食品內的蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌及阪崎腸桿菌的時候，處理樣品時應用PMA，其能將死菌細胞膜透過結合、交聯DNA，形成共價碳氮鍵，能夠帶給死菌DNA于PCR時擴增有效抑制，使檢測更為精準，避免了由于死菌存在，所導致的假陽性結果。在富集培養12h后，能得到100CFU/g的檢測靈敏度。Wang等在檢測活的大腸桿菌O157:H7時，將PMA和PCR技術相結合，死菌影響被消除之后，于牛奶樣本內上午檢測限為5×103CFU/mL；關于發酵乳制品內副干酪乳桿菌活菌的檢測，采用了PMA-qPCR的方法，使死菌影響被消除。

2.5 實時熒光定量PCR技術

熒光定量PCR技術（real-time quantitati ve PCR）誕生于1992年，是由日本人Higuchi所提出，而該技術正式進入市場，則是1996年美國Applied Biosystems公司，其所推出的實時熒光定量PCR儀，使PCR技術真正邁向定量。該技術所具有的最明顯優勢便是將熒光基團加入整體體系，通過積累熒光信號，實現對PCR整個過程的實時檢測，不用內標物，每輪循環均會對熒光信號強度展開檢測。同時，錄入電腦軟件，將各樣品的Ct值計算出來，結合標準曲線，獲得定量結果。事實上，該技術屬于閉管檢測方式，擴增之后不用展開電泳，自動化水平更高，降低了污染程度，使檢測特異性與靈敏度更高。有學者在檢測大腸桿菌O157:H7的時候，為了取得更高的特異性，嘗試把兩種技術相結合，即熒光定量PCR技術+磁珠分離技術，取得了100%的特異性，非O157抗原大腸桿菌無交叉反應出現。開展牛奶樣品模擬檢測時，直接用磁珠從樣品內獲取大腸桿菌O157，使樣品富集步驟略去，PCR受抑制劑影響也得以減少，從而檢測更為快速，達到102CFU/mL的靈敏度。

2.6 重組酶等溫核酸擴增技術

作為體外恒溫核酸擴增的新技術之一，此技術通過對T4噬菌體中核酸復制機制進行模仿，然后借助重組酶UvsX和Gp32單鏈結合蛋白，于體外恒溫環境下結合與識別DNA模板特異性，并且借助鏈置換DNA聚合酶Bsu，有效擴增模板DNA。這一項技術具有諸多優勢：有很高的靈敏度、便捷的操作、時間短等，但缺陷也較為明顯，即對于某些特定短序列核酸束手無策。現如今，針對食源性致病菌或食源性病毒等檢測方面，該技術應用較為廣泛。高建欣等學者，通過將RPA與乳膠微球試紙條（Latex Micro -sphere Test Strips,LMTS）良好結合，再依托金黃色葡萄球菌的基因nuc保守區序列，設計出特異性引物，通過RPA擴增，使金黃色葡萄球菌的檢測更為快速，能夠達到1.2×102CFU/mL的靈敏度。劉立兵等人，建立了志賀氏菌實時熒光重組酶聚合酶擴增檢測技術，具體是根據志賀氏菌侵襲性質的粒抗原H基因（ipaH）保守區序列的設計與exo探針。此方法完成了志賀氏菌的特異性擴增，提高了檢測速度，當處于39℃恒溫時通常20min，能達到3.5×10-3ng/uL的靈敏度，并且在檢測人工污染樣本時，采用此方法，只用7-12min就能完成檢測。GAO等人，則提出一種能實現沙門氏菌快速檢測的RPA-LFD方法建立，在溫度為30-45℃時，很快就能達到相關擴增子檢測閥值，一般在8min左右，在特異性與靈敏度方面優勢明顯。與此同時，檢測食源性致病菌時依托RPA技術，能獲得較為便捷的一類方案。

3.免疫學檢測技術

研究者Berson與yalow在1959年完成了現代發射免疫測定法地創建，主要做法是把免疫反應與發射性同位素示蹤法有機結合，進而揭開了免疫分析領域發展的序幕。發展至今，免疫學技術的特異性強、靈敏度高及簡便等特點，已得到學界的高度認可，多應用于微生物的相關檢測。原理如下，相應抗體和體內外抗原相遇，都能實現各種抗原抗體反應，如沉淀反應、中和反應等。因為特定抗體（抗原）反應強度和量具有密切關系（函數關系），能夠借此對樣品展開定量與定性分析，ELFIA與ELISA等為主要技術。

3.1 ELFIA

Enzyme-Linked Fluorescent Immunoassay，ELFIA即酶聯熒光免疫分析技術。該技術融合了基于酶聯免疫吸附技術發展創建的用酶系統和熒光免疫分析，誕生的一種快速檢測微生物的方法。它有效提升了分析靈敏度，是依托理想熒光底物，替代掉顯色底物，進而在有效擴大測量范圍的同時，避免了試劑的大量使用。劉新亮等學者，采用下述幾個步驟，快速檢測了沙門氏菌：首選，采用全自動熒光酶免疫分析儀（mini VIDAS）完成初篩，隨后用沙門氏菌顯色培養基完成復篩，最后在全自動微生物檢定儀（VITEK 2Compact）作用下，完成陽性菌株生化性狀鑒定。初篩通過此種聯用法，簡短時間內就能完成陽性菌株的精準鑒定，通常時間約為45min，沙門氏菌顯色培養基分離純化陽性菌株之后，結合血清學凝集試驗結果和VITEK檢測結果就能對其是否為沙門氏菌進行判斷。運用這一方法檢測395種水產品與食品中的目標菌，所得結果和國際法完全相同，具有良好的準確性，同時擁有自動化程度高、高效快捷等顯著優點。

3.2 ELISA

酶聯免疫吸附技術，（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）。這項技術的基本原理是，在可溶性抗原（抗體）在某個固定載體表面吸附后，添加酶標抗原（抗體），進而產生抗原和抗體反應及相應復合物，通過洗滌之后，沖洗掉游離的酶標抗原與抗體，再進行酶底物的添加，結合載體上抗原抗體復合物，實現免疫酶染色，對有色產物量進行定量或定性分析，就能得到樣品內待測物質的含量。邵敏等完成了阪崎腸桿菌特異性抗體相關間接ELISA檢測法，結果顯示37℃顯色時間10min，能達到102CFU/mL靈敏度，此方法的顯著特點為效率高，具有很強特異性，并為食品內阪崎腸桿菌的檢測提供了方向。胡金強等用金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶nuc基因為靶標，通過生物素標記探針結合地高標記引物擴增PCR的產物雜交，然后雜交ELISA平板上鏈霉素，最后抗地高辛抗體顯色建立了PCR-ELISA檢測技術，結果顯示，通過PCR-ELISA技術檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，具有101CFU/mL的靈敏度與普通PCR檢測敏感性（103CFU/mL）相比較，要高100倍，實驗全程僅需5-6h。此研究所建立PCR-ELISA方法，可以對牛奶的金黃色葡萄球菌進行準確、敏感及特異地檢測。

結語

在檢測乳制品時，通過生化鑒定等傳統國際檢測方法，不能檢測難培養的致病菌，暴露出特異性不佳、耗時等缺陷，難以做到有效及時的檢測。伴隨分子生物學及免疫學的日益發展，在國內外乳制品快速檢測中PCR技術、免疫學技術及衍生的技術已然得到廣泛應用。然而PCR也存在較為明顯的缺陷，即易產生假陽性、假陰性。與傳統檢測相比，ELISA技術擁有能完成大量樣本同時檢測、操作便捷、準確、快速等特點，但這一技術存在較多的影響因素，其準確度和靈敏度受抗體影響較大，并且結構類似物也可形成程度不一的交叉反應，在未來應用中還應進一步探索操作規程標準化、靈敏度提升、減少各因素影響等方面。不難預見，在科技日益發展的推動下，乳制品中致病菌的檢測及時性、便捷性、準確性、特異性及靈敏度等方面，都將獲得持續改善及發展。