超聲法與閃式提取法提取枳實總黃酮的工藝對比研究

周新新，朱鶴云，范琢玉,2，李樂樂，林曉影，馮 波，崔 悅*，關 皎*

(1. 吉林醫藥學院 藥學院，吉林吉林 132013；2. 延邊大學藥學院，吉林延吉 133002)

枳實為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種或甜橙(CitrussinensisOsbeck)的干燥幼果，為藥食同源中藥，主要分布在四川、湖南等地[1-2]。文獻報道，枳實具有多種藥理作用，包括促進胃腸蠕動[3-5]、抗氧化[6]、抗菌[7]等。其作為脾胃藥，被獸醫用于治療動物便秘、胃積食、胃阻塞等[8-10]，主要活性成分為黃酮類，如柚皮苷、新橙皮苷等[1]。藥材的提取有多種方法，其中超聲法較經典且應用廣泛[11]。閃式提取法則是一種新興的提取方法，具有省時、高效等優點[12-15]。目前，尚未見超聲法和閃式提取法提取枳實總黃酮的對比研究。本文以柚皮苷和新橙皮苷總提取率作為枳實總黃酮提取率[總黃酮的提取率(%)=提取液中總黃酮的含量/藥材質量×100%]為評價指標，通過正交試驗分別優選出兩種方法的最佳工藝并比較，最終確定枳實總黃酮的最佳提取工藝，為枳實在獸藥新藥開發領域和飼料工業化生產方面提供一定依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器 超高快速液相色譜儀(Prominence UFLC)：日本島津公司；微型萬能粉碎機(FW80)：天津市泰斯特儀器有限公司；閃式提取器(JHBE-50S)：河南金鼐科技發展有限公司；超聲波清洗器(KQ-500GVDV)：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 材料 枳實藥材購自吉林市吉林大藥房；柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品購自成都普菲德生物技術有限公司(純度>98%，批號：110730-201614，110729-201714)；無水乙醇為分析純，購自永大化學試劑有限公司；甲醇為色譜級，購自美國Fisher公司。

2 方 法

2.1 枳實總黃酮含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱采用Shim-pack XR-ODS柱(3.0×75 mm，2.2 (m，SHIMADZU)，流動相采用0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序如下：0-10 min，20-30%，檢測波長為265 nm，流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣體積為5 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取柚皮苷和新橙皮苷對照品適量，以甲醇為溶劑制得兩種成分的對照品儲備液分別為280 μg/mL和560 μg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備

2.1.3.1 超聲法 稱取枳實藥材粉末0.5 g于50 mL具塞錐形瓶中，加入50%乙醇35 mL，提取功率200 W，時間75 min。所得濾液經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3.2 閃氏提取法 稱取枳實藥材粉末0.5 g于容器中，加入50%乙醇35 mL，提取時間3 min，其余操作同“2.1.3.1”，即得。

2.1.4 標準曲線的制備 分別取柚皮苷和橙皮苷對照品儲備液適量，以用甲醇為溶劑配制兩種成分的系列混合對照品溶液。柚皮苷濃度為3.5、7、17.5、35、70、140 μg/mL，新橙皮苷濃度為7、14、35、70、140、280 μg/mL

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 標準曲線的建立 以待測物峰面積為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)建立線性回歸方程。

2.1.5.2 精密度試驗 取混合對照品溶液(柚皮苷35 μg/mL，新橙皮苷70 μg/mL)適量，按上述色譜條件連續注入色譜儀中(n=6)，計算兩種成分峰面積的RSD。

2.1.5.3 穩定性試驗 取同一批枳實藥材粉末制備供試品溶液。置于室溫條件下，分別于0、2、8、12、24 h取樣品分析，計算兩種成分峰面積的RSD。

2.1.5.4 重復性試驗 取同一批枳實藥材粉末6份分別制備供試品溶液。進樣分析并計算兩種成分峰面積的RSD。

2.2 提取工藝

2.2.1 超聲法 稱取枳實藥材粉末于提取容器中，按料液比(g/mL，枳實質量/溶劑體積)1∶70加入50%乙醇，提取功率設為200 W，提取75 min。

2.2.2 閃式提取法 稱取枳實藥材粉末于提取容器中，按料液比(g/mL，枳實質量/溶劑體積)1∶70加入50%乙醇，提取3 min。

2.3 工藝比較 按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定并比較兩種方法枳實總黃酮的提取率，確定最佳提取工藝。

3 結果與分析

3.1 色譜條件的建立 混合對照品溶液、枳實樣品溶液色譜圖如圖1所示。

1. 柚皮苷；2. 新橙皮苷1. naringin; 2. neohesperidin圖1 混合對照品溶液(A)和枳實樣品溶液(B)色譜圖Fig 1 Chromatograms of mixed reference solution (A) and Aurantii Fructus Immaturus sample solution (B)

3.2 方法學考察

3.2.1 標準曲線的建立 柚皮苷為Y=1.290×104X+1.659×104(r=0.9998)，新橙皮苷為Y=9.098×103X+2.397×103(r=0.9999)。兩種成分的線性范圍分別為3.5～140 μg/mL，7～280 μg/mL。

3.2.2 精密度試驗 兩種成分峰面積的RSD分別為1.1%和1.0%，表明儀器具有良好的精密度。

3.2.3 穩定性試驗 兩種成分峰面積的RSD分別為0.8%和0.7%，結果表明枳實樣品在24 h內穩定性良好。

3.2.4 重復性試驗 兩種成分峰面積的RSD分別為0.9%和1.1%，表明本方法具有良好的重復性。

3.3 提取工藝

3.3.1 超聲法的正交試驗設計 分別以乙醇濃度(A)、時間(B)、功率(C)和料液比(D)作為考察因素，按表1設計試驗。超聲法正交試驗結果和方差分析結果如表2和表3所示，各因素對提取工藝的影響順序為 A(乙醇濃度)>C(功率)>D(液料比)>B(時間)且各因素對提取工藝均無顯著性差異，最佳工藝為 A1B3C2D3，即用50%乙醇，按料液比1∶70以200 W功率提取75 min。

表1 超聲法正交試驗因素水平表Tab 1 Factors level table of orthogonal test of ultrasonic method

表2 超聲法正交試驗結果Tab 2 Orthogonal test results of ultrasonic method

表3 超聲法方差分析結果Tab 3 Analysis results of ultrasonic method square difference

3.3.2 閃式提取法的正交試驗設計 分別以乙醇濃度(A)、料液比(B)和時間(C)作為考察因素，按表4設計試驗。閃式提取法正交試驗結果和方差分析結果如表5和表6所示，各因素對提取工藝的影響順序為 A(乙醇濃度)>B(液料比)>C(時間)且各因素對提取工藝均無顯著性差異，最佳工藝為 A1B3C3，即用50%乙醇，按料液比1∶70提取3 min。

表4 閃式提取法法正交試驗因素水平表Tab 4 Factors level table of orthogonal test of flash extraction method

表5 閃式提取法正交試驗結果Tab 5 Orthogonal test results of flash extraction method

表6 閃式提取法方差分析結果Tab 6 Square difference analysis results of flash extraction method

3.4 工藝比較 如表7所示，兩種方法枳實總黃酮的最佳提取工藝均為50%乙醇和1∶70的料液比，超聲法提取率(25.26%)高于閃式提取法(18.65%)，但超聲法所用時間(75 min)為閃式提取法(3 min)的25倍。

表7 不同提取方法枳實總黃酮的提取率Tab 7 The extraction rates of total flavonoids from AurantiiFructus Immaturus by different extraction technologies

4 討論與結論

枳實中含有豐富的黃酮類化合物，其中柚皮苷和新橙皮苷的含量最高且較穩定[16]，因此，本實驗以柚皮苷和新橙皮苷提取率之和作為枳實總黃酮提取工藝評價指標。文獻報道，柚皮苷作為飼料添加劑可以調節和控制脂肪代謝、提高肉質、提高動物機體免疫力[17-18]；新橙皮苷能夠促進胃腸道蠕動[19]。枳實是一種應用價值很高的中獸藥，合理的提取工藝對于枳實在畜牧和動物醫學領域的開發和利用具有重要意義。隨著提取工藝的不斷進步，未來枳實總黃酮的提取將更加快速、高效。

單因素試驗中分別考察了乙醇濃度、提取時間、液料比和提取功率等因素；采用正交設計試驗分別優化并比較了超聲法和閃式提取法枳實總黃酮的最佳提取工藝。兩種方法最佳工藝乙醇濃度、料液比均相同。超聲法的提取率為25.26%，閃式提取法的提取率為18.65%，但超聲法所用時長為閃式提取法的25倍。綜合考慮枳實總黃酮的工業化生產對時間和經濟成本的要求，閃式提取法更加省時、簡單和快速，適于大規模的獸藥工業化生產。最終確定閃式提取法為枳實總黃酮的最佳提取方法，其提取工藝為：50%乙醇，料液比1∶70，提取3 min。