不同負荷運動對大鼠骨骼肌氧化應激的影響

侯媛媛 閆文升* 李增明 宋磊剛 趙瑋琳 彭子富

(1.河北體育學院運動醫(yī)學教研室 河北石家莊 050041;2.天津體育學院運動生理與運動醫(yī)學重點實驗室 天津 301617)

運動員的血清睪酮水平是反映其運動能力、肌肉力量、疲勞消除等的重要指標之一，所以血清睪酮已成為運動員身體機能評定中最常用、最成熟的內(nèi)分泌指標［1］。運動項目、運動時間及運動強度等諸多因素影響血清睪酮的含量［2］。缺乏運動及超負荷的體力勞動均可造成體內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和自由基的生成增加，自由基生成率大于機體的清除能力，機體發(fā)生氧化應激，造成細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、線粒體和細胞器受損，導致細胞結(jié)構和功能異常，并且可導致肌肉收縮功能障礙，造成肌肉損傷［3］。而一定時間和強度的運動訓練，能使機體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生適應性變化，提高機體抗氧化酶活性，氧化和抗氧化系統(tǒng)之間保持平衡［4］。

目前，關于不同負荷運動后機體的血睪酮含量、骨骼肌氧化應激水平及抗氧化酶基因表達情況如何，以及相應的骨骼肌形態(tài)學變化特點，有待進一步研究明確。該實驗以成年雄性SD 大鼠為實驗對象，4 周不同強度跑臺訓練為運動干預方案，觀察不同負荷運動對血清睪酮水平、骨骼肌自由基代謝、抗氧化酶活性和基因表達及形態(tài)學的影響，以期探索出適宜運動負荷，防止骨骼肌運動損傷，達到最佳運動效果，為科學制定運動處方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

32 只成年雄性SD 大鼠購自河北醫(yī)科大學動物中心。飼養(yǎng)溫度控制在（22±2）℃，12h亮黑循環(huán)（06：00～18：00 照明），食物和水供給充足。所有大鼠在動物室內(nèi)適應性飼養(yǎng)1周后正式實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及干預方式

建立不同負荷運動大鼠模型［5］，分為安靜組、小強度組、中強度組和大強度組，每組8只，共32只，跑臺運動4周。小強度組：第1周10min/天（10m/min），第2～4周20min/天（15m/min）；中強度組：第1 周30min/天（10m/min），第2～4周60min/天（15m/min）；大強度組：第1周60min/天（10m/min），第2～4周120min/天（15m/min）。安靜組：進行必要的鼠籠清潔，其他不做任何干預。

1.2.2 測試樣品制備

整個運動干預結(jié)束后取材，直接斷頭取血，將血液于室溫靜置30min，于低溫離心機中（3000r/min）離心15min，取血清用于睪酮水平測定。同時，分離右側(cè)比目魚肌（同一位置），預冷PBS緩沖液沖洗表面血液，錫箔紙包裹、標記后于液氮保存用于實時熒光定量PCR（qPCR）檢測。另取新鮮比目魚肌組織制備成10%的組織勻漿，以3000r/min 的速度，離心15min 取上清，用于骨骼肌抗氧化劑Mn-SOD、GSH-PX及脂質(zhì)過氧化物MDA水平的檢測。取左側(cè)比目魚肌樣本，HE染色樣品制備，室溫保存。

1.2.3 血清睪酮濃度檢測

以放射免疫分析法檢測血清睪酮的含量。實驗步驟嚴格按照碘（125I）睪酮放射免疫分析試劑盒說明書。

1.2.4 骨骼肌組織切片及蘇木精-伊紅染色

完成固定后的標本依次進行脫水-透明-浸蠟-包埋。取樣本切片，切片厚度4μm，行蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-Eosin Staining，HE 染色）。Leica 倒置光學顯微鏡觀察（Leica Co，Germany），選取視野進行觀察拍照，觀察形態(tài)學變化及炎性細胞浸潤情況。

1.2.5 骨骼肌Mn-SOD、GSH-PX及MDA水平檢測

Mn-SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法，GSH-PX測定采用比色法測定，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法。檢測嚴格按照測試盒的操作程序進行測定。

1.2.6 qPCR檢測

提取比目魚肌組織總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、擴增。反應條件：95℃預變性15min，95℃變性10s，退火/延伸72℃20s，共40 個循環(huán)。用2-ΔΔCt法來計算Mn-SOD 和GSHPX mRNA的相對表達量。引物序列如下：Mn-SOD（5′-ACAACTCCCAGAAGCCTAAGAATG-3′and5′-GCTT TTCCCTTGGCAGCTATG-3′），GSH-PX（5′-AATCAG TTCGGACATCAGGAG-3′and5′-GAAGGTAAAGAGCG GGTGAG-3′），以GAPDH為內(nèi)參基因，GAPDH（5′-GAC TCTTACCCACGGCAAGTT-3′and5′-GGTGATGGGTTT CCCGTTGA-3′）。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有參數(shù)以平均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析法（Oneway analysis of variance，one-way ANOVA），P<0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重

對實驗前各組體重進行分析顯示：各組動物的體重無顯著差異。對各組動物4周后體重增長量進行分析（見表1）：隨著運動負荷的逐漸增加，體重增長量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，且組間存在顯著性差異（P<0.05），大強度組的體重增長量比安靜組降低了31%，小強度組及中強度組的體重增長量與安靜組相比無顯著性差異。

表1 不同運動負荷實驗前、后動物體重測量（g）

2.2 大鼠血清睪酮水平

經(jīng)過4 周訓練后，安靜組大鼠血清睪酮水平為439.8±36.40ng/dl，小強度組血清睪酮水平為465.6±39.83ng/dl，與安靜組相比無顯著差異。安靜組、中強度組和大強度組各組之間血清睪酮水平存在顯著差異，中強度組血清睪酮水平為770.3±43.06ng/dl，顯著高于安靜組（P<0.01）；大強度組血清睪酮水平為140.1±21.69ng/dl，顯著低于安靜組（P<0.01）（見圖1）。

圖1 不同運動負荷實驗組血清睪酮水平

2.3 大鼠比目魚肌顯微結(jié)構觀察

光鏡下觀察安靜組（見圖2a）及小強度組（見圖2b）比目魚肌肌束排列整齊，無淤血、無炎細胞浸潤及水腫；中強度組（見圖2c）肌束間隙增寬，肌束增粗；大強度組（見圖2d）肌束間血管擴張、淤血，多灶性慢性炎細胞聚集，血管周圍慢性炎細胞浸潤（見圖2）。

圖2 不同運動負荷實驗組比目魚肌形態(tài)學變化（HE染色，200×）

2.4 大鼠比目魚肌氧化應激參數(shù)

實驗結(jié)果顯示，小強度組比目魚肌中的Mn-SOD和GSH-PX 活性、MDA 的量與安靜組相比，無顯著差異。安靜組、中強度組和大強度組各組之間比目魚肌的Mn-SOD（P<0.01）（見圖3）、GSH-PX 活性（P<0.01）（見圖4）和MDA的量（P<0.01）（見圖5）存在明顯差異。中強度組比目魚肌Mn-SOD 和GSH-PX 活性、MDA 的量與安靜組相比，Mn-SOD 和GSH-PX 活性顯著升高，MDA 水平降低（P<0.01）；大強度組比目魚肌Mn-SOD和GSH-PX活性、MDA的量與安靜組相比，Mn-SOD和GSH-PX 活性顯著降低，MDA 的量升高（P<0.01）（見圖3、圖4、圖5）。

圖3 不同運動負荷實驗對比目魚肌Mn-SOD的影響

圖4 不同運動負荷實驗對比目魚肌GSH-PX的影響

圖5 不同運動負荷實驗對比目魚肌MDA的影響

2.5 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達

實驗結(jié)果顯示，小強度組比目魚肌中的MnSOD RNA 和GSH-PX RNA 表達與安靜組相比，無顯著差異。安靜組、中強度組和大強度組各組之間比目魚肌的Mn-SOD RNA（p<0.01）（見圖6）、GSH-PX RNA（P<0.01）（見圖7）表達存在明顯差異，中強度組MnSOD RNA 和GSH-PX RNA 表達均與安靜組相比顯著增加（P<0.01），大強度組MnSOD RNA和GSH-PX RNA表達與安靜組相比均明顯下降（P<0.01）。

圖6 不同運動負荷實驗對比目魚肌Mn-SOD基因表達的影響

圖7 不同運動負荷實驗對比目魚肌GSH-PX基因表達的影響

3 討論

該研究利用組織染色、生物化學及qPCR等方法進行實驗，發(fā)現(xiàn)隨著運動負荷的逐漸增加，大鼠體重增長量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，長時間大強度運動，體重降低明顯。長時間中強度運動，血清睪酮含量增加，比目魚肌肌束間隙增寬，肌束增粗，Mn-SOD、GSH-PX活性和基因表達顯著升高，MDA含量顯著下降；長時間大強度運動可顯著降低血清睪酮含量，比目魚肌肌束間血管擴張淤血，多灶性慢性炎細胞聚集，血管周圍慢性炎細胞浸潤，Mn-SOD、GSH-PX活性和基因表達顯著降低，MDA 含量顯著升高；安靜組和小強度組比目魚肌血清睪酮、組織形態(tài)、氧化應激參數(shù)、Mn-SOD和GSH-PX基因表達未見明顯改變。這些研究結(jié)果表明不同負荷運動可以影響骨骼肌的氧化應激水平，影響骨骼肌的形態(tài)學特點。

氧化應激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，抗氧化的代表酶，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutases，SODs）用于專一清除超氧陰離子自由基（O2-），是體內(nèi)對抗自由基的第一道防線，其中錳超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase，MnSOD）被認為是哺乳動物最重要的SOD［6，7］。谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）可以代謝細胞內(nèi)的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），進而抑制ROS 毒害作用，維持細胞的穩(wěn)態(tài)。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是氧化產(chǎn)物的代表性產(chǎn)物，其含量的高低間接反映自由基損害所造成的脂質(zhì)過氧化的程度，是反映自由基介導細胞損傷的指標［8］。該研究的中強度運動提高了Mn-SOD 和GSH-PX 活性、mRNA 表達，促進MDA的清除，說明運動增強了大鼠骨骼肌的抗氧化能力，避免了自由基對骨骼肌的損傷。

長期大強度運動導致骨骼肌中Mn-SOD 和GSHPX活性、mRNA表達降低，MDA水平升高，提示長時間大強度運動大鼠的抗氧化能力降低，氧化損傷增加。長時間大強度運動，為了能夠提供足夠的能量，體內(nèi)代謝增加，體重減輕，線粒體耗氧量在增加，呼吸水平提高，產(chǎn)生更多的氧自由基，可能由于機體疲勞不能產(chǎn)生正常的生理應激反應，抗氧化酶活性反而下降，不能有效消除運動引起的高ROS 和自由基水平，引起組織結(jié)構功能紊亂，造成骨骼肌和腦等器官損傷［9，10］。

金雯等人［11］研究發(fā)現(xiàn)，每天0.5h、1h、2h 游泳訓練均可以引起衰老大鼠股四頭肌SOD、GSH-Px活性的升高，以1h運動組效果最優(yōu)，并且有效地減少MDA含量。潘瑋敏等人［12］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4周游泳訓練，小負荷訓練組大鼠腓腸肌細胞膜MDA 含量降低，SOD 活性升高，大負荷訓練組MDA 含量和SOD 活性無顯著性差異。雷曉妮等人［13］研究老年小鼠10周游泳運動后，無負荷老年運動組小鼠腓腸肌MDA 含量明顯下降，SOD活性顯著升高，GSH-PX 活性極顯著增高；負荷老年運動組小鼠腓腸肌GSH-PX 活性顯著升高，MDA 含量和SOD 活性無顯著性變化，負荷運動和無負荷運動交替組小鼠GSH-PX 和SOD 活性極顯著升高，MDA 含量明顯下降。朱天宇［14］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4周跑臺運動，低強度組和中強度組大鼠腓腸肌SOD 水平明顯升高，MDA水平明顯降低，而高強度組SOD 水平明顯降低，MDA水平明顯升高。

運動后提高機體抗氧化的能力不同，可能與實驗對象和實驗器官的選擇、運動方式、運動強度和運動時間等因素有關，研究中同為設定的低、中、高負荷的標準也各不相同，提示對不同對象開具的運動處方應采取個體化原則，以免造成機體的損傷。

睪酮是體內(nèi)主要的雄激素，男性大部分由睪丸間質(zhì)細胞產(chǎn)生，小部分由腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶產(chǎn)生。運動可以調(diào)節(jié)血清睪酮的變化［15，16］，運動性血睪酮變化一直是運動員身體機能檢測的常用指標之一。該研究發(fā)現(xiàn)，安靜組和小強度組大鼠血清睪酮水平無顯著差異，中強度組血清睪酮水平顯著升高，大強度組血清睪酮水平降低明顯。雄激素在骨骼肌蛋白質(zhì)代謝和肌肉質(zhì)量控制中發(fā)揮了重要作用，雄激素通過IGF-1/Akt、ERK/mTOR 和GPCR 等信號途徑促進骨骼肌蛋白質(zhì)合成，促進肌肉生長質(zhì)量增加，運動加強了雄激素的促肌肉合成效應［17，18］；而雄激素匱乏時可通過自噬、泛素蛋白酶體系統(tǒng)等途徑促進蛋白質(zhì)分解，導致肌肉質(zhì)量的流失。

基于老年雄性存在睪酮水平降低［19，20］，老年雄性大鼠給予睪酮補充能夠改善運動行為和運動技能及增加中樞神經(jīng)腦的抗氧化能力和降低氧化損傷。去勢大鼠皮下給予丙酸睪酮后能夠恢復黑質(zhì)和海馬腦區(qū)線粒體的氧化應激指標［21］，表明雄激素不足引起的相關氧化應激與體內(nèi)雄激素水平的減少有關。運動的影響是廣泛的，運動對骨骼肌氧化應激的調(diào)節(jié)或許與睪酮有協(xié)同效應，還是通過復雜的信號機制來實現(xiàn)調(diào)節(jié)Mn-SOD、GSH-PX表達，還需進一步研究。