核因子2相關因子2激動劑dh404對異氟醚誘導認知功能障礙大鼠腦海馬組織的影響

張縱橫, 朱全智, 丁蕾

術后認知功能障礙（POCD）是病人手術麻醉后出現的一種中樞神經系統并發癥, 主要臨床表現為病人術后出現學習、記憶、判斷力、注意力等下降[1］。研究發現異氟醚麻醉可致術后認知功能障礙, 可能與異氟醚加劇氧化應激反應, 增加腦內海馬神經元凋亡有關[2］。核因子2相關因子2（Nrf2）是一種轉錄因子, 氧化應激時能結合抗氧化反應元件啟動氧化應激相關基因的轉錄[3］。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）是Nrf2負調控因子, 具有重要的抗氧化應激調控機制[4］。血紅素加氧酶1（HO-1）作為一種應激蛋白, 在應激和疾病條件下具有抗炎、抗組織損傷、抗氧化及保護細胞黏膜等積極作用, 是Nrf2下游的抗氧化基因[5］。本研究起止時間為2018年12月至2019年8月。本研究擬探討Nrf2激動劑dh404改善異氟醚麻醉誘導的認知功能障礙, 進一步探討Nrf2信號通路在氟醚麻醉誘導的認知功能障礙大鼠腦組織中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 選擇清潔級SD雄性大鼠24只, 鼠齡8～12周, 體質量范圍為250～280 g, 購自中國科學院昆明動物研究所, 動物生產許可證號為SCXK（滇）K2016-0001, 醫學實驗動物使用許可證號為SYXK（滇）K2017-0009。無特定病原體級動物房飼養條件：溫度范圍為22～26 ℃, 相對濕度范圍為40%～60%, 適應性喂養3 d。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 實驗主要試劑 Nrf2激動劑dh404（Reata制藥公司, 批號HY-112671）、異氟醚（美國雅培制藥有限公司）、Nrf2、HO-1、Keap1、β肌動蛋白（β-actin）PCR正反向引物（上海生工公司）、Nrf2兔單克隆抗體、HO-1兔單克隆抗體、Keap1兔單克隆抗體（均購自美國Abcam公司）、山羊抗兔二抗（購自美國LICOR公司）、丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（均購自南京建成生物工程研究所）。

1.1.3 主要儀器 Drager Fabius型麻醉機（德國Drager公司）、Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設備有限公司）、實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）、酶標儀（Thermo公司）、石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司）、正置光學顯微鏡、成像系統（日本尼康）。

1.2 建立動物模型、分組24只大鼠均于清潔級動物房適應性飼養1周后按照隨機數字表法將24只大鼠分為三組, 對照組、異氟醚組、Nrf2激動劑dh404+異氟醚組（dh404組）, 每組8只。dh404組在吸入異氟醚前30 min腹腔注射Nrf2激動劑dh404（1.5 mg/kg）, 對照組和異氟醚組注射等量的生理鹽水。將各麻醉組大鼠放置于麻醉箱中, 經麻醉機向箱內充入30%氧氣的空氣, 調節揮發罐使異氟醚濃度為2%, 持續時間6 h。將對照組大鼠置于含30%氧氣的空氣中6 h。各組在麻醉期間經腹腔注射補充葡萄糖及生理鹽水, 每2小時1次, 0.5毫升/次。

1.3 觀察指標

1.3.1 Morris水迷宮測試 麻醉前一天進行適應性訓練。參照參考文獻[6］, 各組大鼠在麻醉結束后24 h進行Morris水迷宮測試。①定位航行實驗：每天訓練4次, 連續5 d。將大鼠分別從不同象限面向池壁輕放入池中, 限時60 s, 記錄大鼠從入水到爬上平臺所用的時間, 即逃避潛伏期。將60 s內找不到平臺的大鼠逃避潛伏期記為60 s。②空間探索實驗：在大鼠完成最后一次定位航行實驗結束24 h后, 撤去平臺, 任選一入水點將大鼠放入水池內, 記錄60 s內在原平臺所在象限的探索時間及穿越平臺次數。測試結束后立即處死大鼠, 取腦海馬組織進行后續實驗。

1.3.2 采用免疫組織化學法檢測腦海馬組織Nrf2表達情況 將4%多聚甲醛固定腦組織, 用刀片將腦組織切成2 mm厚的組織塊, 放入一次性蠟盒中, 脫水、透明、浸蠟、包埋后, 蠟塊在組織切片機上連續切片, 片厚4 μm。經二甲苯脫蠟、乙醇逐步水化后高溫抗原修復20 min。3%雙氧水室溫避光浸泡10 min。每張切片的組織上滴加50 μL山羊血清, 封閉30 min后, 加50 μL兔抗鼠Nrf2抗體孵育, 4 ℃過夜。次日, 棄去一抗后滴加二抗孵育30 min。滴加DAB顯色劑, 鏡下觀察組織顏色。之后進行蘇木素復染, 中性樹脂封片。顯微鏡下觀察Nrf2的蛋白表達水平。

1.3.3 采用蛋白質印跡法檢測腦組織HO-1、Keap1表達水平 提取腦組織總蛋白, 蛋白質定量試劑盒定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）后轉膜至聚偏二氟乙烯2 h, 5%脫脂牛奶封閉1 h, 洗滌緩沖液洗膜后加入一抗（1∶1 000稀釋）, 孵育2 h, 加入二抗（1∶3 000稀釋）, 室溫孵育2 h。電化學發光顯影, 以β-actin為內參, 凝膠成像系統分析目的蛋白與內參條帶的相對灰度值。

1.3.4 采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測腦組織Nrf2、HO-1、Keap1表達水平 Trizol法提取腦組織總RNA并逆轉錄, 采用SYBR Green I實時熒光定量PCR方法檢測各組腦組織Nrf2、HO-1、Keap1基因的表達水平。引物設計如下：Nrf2正向5'-CCATTCCCGAGTTACAGTGTCTT-3', 反 向5'-GATCGATGAGTAAAAATGGTAATTGC-3'；HO-1正向5'-AGCATGTTCCCAGGATG-3', 反向5'-GCTCAATGTTGAGCACA-3'；Keap1正向5'-GGTACGACGTGGAGACAGAG-3', 反向5'-TAGCCTCCGAGGACGTAGAT-3'；β-actin正向5'-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3', 反 向5'-CGTCATCCA TGGCGAACTGG-3'。每個樣本重復檢測3次。基因的相對表達量按2-ΔΔCt法計算。

1.3.5 分別檢測腦組織MDA、SOD、GSH-Px的表達水平 將腦組織用冰鹽水沖洗, 試紙擦干后稱重, 按體質量體積比1∶9加入生理鹽水, 研磨制成10%腦勻漿。4 ℃, 5 000 r/min離心10 min, 按照試劑盒說明書分別采用TBA法檢測腦組織MDA濃度、WST-1法檢測腦組織SOD活性和分光光度法檢測腦組織GSH-Px活性。

1.4 統計學方法采用SPSS 20.0軟件進行數據分析, 所有計量數據均呈正態分布, 結果用xˉ ±s表示, 多組間比較采用單因素方差分析, 多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠認知功能的比較與對照組相比, 異氟醚組大鼠逃避潛伏期長, 平臺所在象限停留時間及穿越平臺次數減少（P＜0.05）；與異氟醚組相比, dh404組大鼠逃避潛伏期縮短, 平臺所在象限停留時間及穿越平臺次數增加（P＜0.05）。見表1。

表1 dh404對異氟醚麻醉后各組大鼠認知功能的影響/xˉ ±s

2.2 各組大鼠腦海馬組織Nrf2表達情況腦海馬組織CA1區免疫組織化學結果見圖1。異氟醚組大鼠中可見少量Nrf2核陽性細胞, dh404組大鼠腦組織中可見大量核陽性細胞, 見圖2。qRT-PCR結果顯示, dh404組大鼠腦組織Nrf2 mRNA表達水平（6.70±0.98）高于對照組（1.00±0.12）及異氟醚組（1.16±0.15）（F=95.63,P＜0.001）, 而異氟醚組與對照組Nrf2 mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腦海馬組織CA1區結構切片染色圖（免疫組織化學染色×400）：1A為對照組；1B為異氟醚組；1C為dh404組

圖2 各組大鼠腦海馬組織Nrf2表達情況（免疫組織化學染色×400）：2A為對照組；2B為異氟醚組；2C為dh404組

2.3 各組大鼠腦海馬組織HO-1、Keap1表達水平蛋白質印跡法和qRT-PCR結果均顯示, 與對照組相比, 異氟醚組和dh404組大鼠腦組織HO-1蛋白和mRNA表達減少、Keap1蛋白和mRNA表達升高（P＜0.05）；與異氟醚組相比, dh404組大鼠HO-1蛋白和mRNA表達升高、Keap1蛋白和mRNA表達減少（P＜0.05）。見表2, 圖3。

圖3 各組大鼠腦組織HO-1、Keap1蛋白表達水平

表2 dh404對各組大鼠腦組織HO-1蛋白、Keap1和mRNA表達的影響/xˉ ±s

2.4 各組大鼠腦勻漿丙二醛濃度、SOD及GSH-Px活性與對照組相比, 異氟醚組和dh404組大鼠丙二醛濃度增加而SOD、GSH-Px活性降低（P＜0.05）；與異氟醚組相比, dh404組大鼠丙二醛濃度減少而SOD、GSH-Px活性增強（P＜0.05）。見表3。

表3 dh404對各組大鼠腦勻漿丙二醛濃度、SOD及GSH-Px活性的影響/xˉ ±s

3 討論

異氟醚是臨床上最常用的吸入性麻醉藥物之一。研究表明, 異氟醚可誘發中樞神經毒性, 導致術后認知功能減退[7-8］。異氟醚的濃度、麻醉時間、指標檢測時間的不同可導致其對新生大鼠遠期認知功能的影響不同[9］。曹高亞等[10］研究表明持續吸入異氟醚對空間記憶能力的影響顯著, 而且長時間高濃度的吸入方式造成的影響時間較長；Wang等[11］研究發現, 1.5%異氟醚治療2 h會損害嚙齒動物的認知功能, 包括學習記憶功能和焦慮相關行為。水迷宮是檢測海馬功能直接相關的空間學習記憶能力的經典行為學實驗手段[12］。本研究結果發現, 異氟醚組大鼠逃避潛伏期與對照組比長, 平臺所在象限停留時間及穿越平臺次數與對照組比減少。表明大鼠異氟醚麻醉后引發認知功能障礙。

Nrf2是一種細胞質蛋白, 在被ROS或親電子試劑激活后進入細胞核, 識別ARE, 編碼下游抗氧化蛋白（Nrf2、HO-1及SOD-1）而發揮內源性抗氧化作用, Nrf2、HO-1和SOD-1及其mRNA表達水平可間接反映Nrf2信號通路激活情況[13-14］。有研究顯示, 吸入1.5%異氟醚能夠誘導氧化應激并影響神經和認知發育, 而PKCα/Nrf2信號通路的激活具有神經保護作用[15］。另有研究發現, 高壓氧預處理對異氟烷誘導小鼠術后認知功能障礙模型中的記憶缺陷具有神經保護作用, 可能與通過激活Nrf2/HO-1途徑介導有關[16］。本研究結果發現, 異氟醚組大鼠腦組織中可見少量Nrf2核陽性細胞, 而異氟醚組和dh404組大鼠腦組織Keap1表達水平升高、HO-1表達水平減少, 提示異氟醚可通過氧化應激誘導大鼠發生認知功能障礙, 吸入異氟醚后, Nrf2表達水平呈應激性升高, 但無法有效減輕大鼠腦組織氧化應激水平。因此, 本研究觀察Nrf2激動劑dh404對神經認知的保護作用。Morris水迷宮實驗結果表明, dh404組大鼠相關指標均有所改善。且dh404組大鼠腦組織中可見大量核陽性細胞, Nrf2、HO-1表達水平升高而Keap1表達水平減少。提示預給予dh404可以有效改善異氟醚麻醉所誘導大鼠空間學習能力下降, 可能與Nrf2信號通路激活, 從而起到腦保護作用有關。

麻醉手術過程中會增加機體氧化應激壓力, 對機體造成進一步損害。丙二醛能夠反映細胞受氧自由基損傷的程度, 而SOD活性高低反應機體抗氧化能力[17］。GSH-Px屬于體內分布較廣的過氧化物分解酶, 其活性高低反應了機體清除氧自由基的能力, 是機體氧化應激反應的靈敏指標[18］。SOD、GSH-Px和過氧化氫酶共同構成機體抗氧化防御系統, 能直接反映機體抗氧化能力[19］。本研究結果發現, 與對照組相比, 異氟醚組和dh404組大鼠丙二醛濃度增加而SOD、GSH-Px活性降低；與異氟醚組相比, dh404組大鼠丙二醛濃度減少而SOD、GSH-Px活性增強。提示dh404可起到保護異氟醚誘導認知功能障礙的大鼠, 其可能的作用機制是Nrf2信號通路激活起到抗氧化作用。

綜上所述, 異氟醚6 h吸入可誘發大鼠認知功能障礙與腦組織氧化應激水平增高有關, 促進Nrf2信號通路激活可改善異氟醚6 h吸入導致認知功能損害。