LHFPL3-AS1 靶向miR-515-5p 對(duì)胃癌順鉑耐藥細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

朱婷婷，厲挺，趙葉芳

紹興第二醫(yī)院內(nèi)鏡中心，浙江紹興 312000

化療是胃癌的重要治療手段之一，術(shù)前和術(shù)后聯(lián)合化療在提高胃癌患者生存率方面具有良好療效。順鉑是臨床應(yīng)用最普遍的化療藥物，但其耐藥性仍是胃癌患者有效化療和改善預(yù)后的最大障礙[1]。探討胃癌順鉑耐藥的機(jī)制對(duì)克服胃癌化療耐藥具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中大量長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）表達(dá)異常，lncRNA可調(diào)控不同信號(hào)通路進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥和凋亡，是腫瘤治療和化療增敏的潛在靶點(diǎn)[2-3]。研究報(bào)道lncRNA LHFPL3-AS1 在黑色素瘤中表達(dá)上調(diào)，可抑制黑色素瘤干細(xì)胞凋亡[4]。LHFPL3-AS1 下調(diào)可明顯抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制順鉑耐藥[5]。然而，LHFPL3-AS1 在胃癌中的具體作用尚不清楚。靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-515-5p 是LHFPL3-AS1 的潛在靶點(diǎn)。既往研究證實(shí)上調(diào)miR-515-5p 可顯著降低胃癌細(xì)胞活力，抑制集落形成和侵襲能力[6]。miR-515-5p 通過靶向Notch1 明顯抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，增強(qiáng)藥物敏感性[7]。基于上述背景，本研究探討LHFPL3-AS1 靶向miR-515-5p 對(duì)胃癌順鉑耐藥細(xì)胞惡性行為的影響，旨在為克服胃癌順鉑耐藥提供有效靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

胃癌親本細(xì)胞 HGC-27 及耐藥細(xì)胞 HGC-27/DDP、人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1（中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒（大連Takara 生物公司，批號(hào)：20181123）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）（南京恩晶生物科技公司，批號(hào)：20190510）；熒光素酶報(bào)告載體、miRNA 模擬物（mimic）、miRNA 抑制物（inhibitor）、小干擾RNA（si-RNA）（廣州銳博生物公司，批號(hào)：20171105、20190326、20180611、20171025）；Transwell 小室（北京優(yōu)尼康生物公司，批號(hào)：20180520）；兔源E 鈣黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗體（AF6759）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（A0208）、兔源甘油醛-3-磷酸（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（AF1186）、兔源N 鈣黏蛋白（N-cadherin）多克隆抗體（AF0243）（上海碧云天生物公司，批號(hào)：20160520、20180326、20171104、20180718）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) GES-1 細(xì)胞、HGC-27 細(xì)胞、HGC-27/DDP 細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，在含5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰酶消化80%融合度細(xì)胞，隔日換液，每3 天換液一次。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取 5×103個(gè)HGC-27 或HGC-27/DDP 細(xì)胞接種96 孔板，細(xì)胞貼壁后用含不同濃度（0～12μmol/L 或0～500μmol/L）順鉑的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48h，隨后加入CCK-8 溶液（10μl/孔），37℃孵育2.5h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm 處各孔的吸光度（A）。細(xì)胞存活率（%）=（A實(shí)驗(yàn)孔–A空白孔）/（A對(duì)照孔–A空白孔）×100%。計(jì)算HGC-27、HGC-27/DDP細(xì)胞的IC50值。

1.2.2 LHFPL3-AS1 和miR-515-5p 表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)細(xì)胞中LHFPL3-AS1 和miR-515-5p 表達(dá)。TRIzol 試劑提取GES-1、HGC-27 和HGC-27/DDP 細(xì)胞的總RNA，取1μg 總RNA 按照PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。GAPDH 作為LHFPL3-AS1 的內(nèi)參，U6 作為miR-515-5p的內(nèi)參，2-△△CT法計(jì)算LHFPL3-AS1 和miR-515-5p 相對(duì)水平。LHFPL3-AS1上游引物5′-GTGAAGTCATGGGAAGGCAAG-3′，下游引物5′-CCCTCTCTGCCTGCAACTTAG-3′；GAPDH 上游引物5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游引物5′-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3′；miR-515-5p上游引物5′-TTCTCCAAAAGAAAGCACTTTCTG-3′，下游引物5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′；U6 上游引物5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物5′-GTGCAGGG TCCGAGG-3′。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)一：取 1×104個(gè)對(duì)數(shù)期HGC-27/DDP 細(xì)胞接種24 孔板，分為對(duì)照（Con）組（未轉(zhuǎn)染 HGC-27/DDP 細(xì)胞）、si-NC 組、si-LHFPL3-AS1 A 組（轉(zhuǎn)染si-LHFPL3-AS1 干擾序列A）、si-LHFPL3-AS1 B 組（轉(zhuǎn)染si-LHFPL3-AS1干擾序列 B）和 si-LHFPL3-AS1 C 組（轉(zhuǎn)染si-LHFPL3-AS1 干擾序列C），轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000 試劑，轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞，RT-qPCR 分析LHFPL3-AS1 相對(duì)水平以篩選合適的干擾序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)二：取1×104個(gè)對(duì)數(shù)期HGC-27/DDP細(xì)胞接種24 孔板，用Lipofectamine 2000 在40%匯合細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染 si-LHFPL3-AS1、miR-515-5p mimic、si-NC、miR-NC、si-LHFPL3-AS1+miR-515-5p inhibitor，轉(zhuǎn)染 48h 收集細(xì)胞，RT-qPCR 分析LHFPL3-AS1 或miR-515-5p 相對(duì)水平以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。HGC-27/DDP 細(xì)胞共分為si-NC 組、si-LHFPL3-AS1 組、miR-NC 組、miR-515-5p mimic 組、si-LHFPL3-AS1+miR-515-5p inhibitor 組。未轉(zhuǎn)染HGC-27/DDP 細(xì)胞計(jì)為對(duì)照（Con）組。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)測(cè)的miR-515-5p結(jié)合位點(diǎn)將 LHFPL3-AS1 野生型（wt）序列或LHFPL3-AS1 突變型（mut）序列分別克隆到pmirGLO熒光素酶報(bào)告載體中構(gòu)建重組載體wt-LHFPL3-AS1、mut-LHFPL3-AS1。在HGC-27/DDP 細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染重組載體與miR-515-5p mimic 或miR-NC。通過雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)評(píng)估轉(zhuǎn)染48h HGC-27/DDP 細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.5 HGC-27/DDP 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK-8 法檢測(cè)HGC-27/DDP 細(xì)胞活力。Con 組、si-NC 組、si-LHFPL3-AS1 組、miR-NC 組、miR-515-5p mimic組、si-LHFPL3-AS1+miR-515-5p inhibitor 組各取5×103個(gè)細(xì)胞接種96 孔板，隨后加入CCK-8 溶液（10μl/孔），37℃孵育2.5h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm 處各孔的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.6 平板克隆實(shí)驗(yàn) Con 組、si-NC 組、si-LHFPL3-AS1 組、miR-NC 組、miR-515-5p mimic 組、si-LHFPL3-AS1+miR-515-5p inhibitor 組各取3×102個(gè)細(xì)胞接種6 孔板，適時(shí)更換培養(yǎng)液。在培養(yǎng)箱孵育至出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)，取出6 孔板，棄去培養(yǎng)液。用磷酸鹽緩沖液沖洗6 孔板2 次，分別用4%多聚甲醛、0.5%結(jié)晶紫進(jìn)行固定和染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)（大于50 個(gè)細(xì)胞）。

1.2.7 HGC-27/DDP 細(xì)胞遷移和侵襲的檢測(cè) 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HGC-27/DDP 細(xì)胞遷移和侵襲能力。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液按照1 ∶8 比例稀釋Matrigel，取50μl 加入Transwell 小室上室，4℃過夜備用。用無血清培養(yǎng)基重懸Con 組、si-NC 組、si-LHFPL3-AS1 組、miR-NC 組、miR-515-5p mimic組、si-LHFPL3-AS1+miR-515-5p inhibitor 組HGC-27/DDP 細(xì)胞，取200μl 細(xì)胞懸液加入到上室，取500μl 細(xì)胞培養(yǎng)液（補(bǔ)充10%胎牛血清）加入到24孔板下室。37℃孵育24h 后，穿膜細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定，隨后用0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)Transwell 板不涂基質(zhì)膠。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)E-cadherin 和N-cadherin蛋白表達(dá) 用RIPA 裂解緩沖液提取Con 組、si-NC組、si-LHFPL3-AS1 組、miR-NC 組、miR-515-5p mimic 組、si-LHFPL3-AS1+miR-515-5p inhibitor 組HGC-27/DDP 細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后，進(jìn)行SDS-PAGE 和濕法轉(zhuǎn)膜。25℃下5%脫脂牛奶封閉膜2h，加入1 ∶800稀釋的E-cadherin、1 ∶600稀釋的N-cadherin、1 ∶2000稀釋的GAPDH 的一抗4℃孵育過夜。然后將膜與1 ∶1000稀釋的山羊抗兔IgG二抗25℃孵育2h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，Image J 6.0 軟件檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和 SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HGC-27 和HGC-27/DDP 對(duì)順鉑的敏感性

用不同濃度的順鉑處理 HGC-27 和 HGC-27/DDP 細(xì)胞，隨著順鉑濃度增加，HGC-27 和HGC-27/DDP 細(xì)胞的存活率逐漸降低，HGC-27/DDP細(xì)胞的 IC50（236.20μmol/L）高于 HGC-27 細(xì)胞（5.83μmol/L），見圖1。

圖1 不同濃度順鉑對(duì)HGC-27 和HGC-27/DDP 細(xì)胞存活率的影響

2.2 LHFPL3-AS1 和miR-515-5p 在不同細(xì)胞中的表達(dá)

與GES-1 細(xì)胞比較，HGC-27 和HGC-27/DDP細(xì)胞中LHFPL3-AS1 相對(duì)水平顯著升高（P<0.05），miR-515-5p 相對(duì)水平顯著降低（P<0.05），見圖2。與Con 組、si-NC 組比較，si-LHFPL3-AS1 A/B/C 組HGC-27/DDP 細(xì)胞LHFPL3-AS1 相對(duì)水平顯著降低（P<0.05），選擇 LHFPL3-AS1 相對(duì)水平較低的si-LHFPL3-AS1 C 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。與Con 組、si-NC 組比較，si-LHFPL3-AS1 組HGC-27/DDP 細(xì)胞miR-515-5p相對(duì)水平顯著升高（P<0.05）；miR-515-5p mimic 組HGC-27/DDP 細(xì)胞miR-515-5p 相對(duì)水平顯著高于miR-NC 組（P<0.05）；與si-LHFPL3-AS1 組比較，si-LHFPL3-AS1+miR-515-5p inhibitor 組 HGC-27/DDP 細(xì)胞miR-515-5p 相對(duì)水平顯著降低（P<0.05），見圖3。

圖2 GES-1、HGC-27 和HGC-27/DDP 細(xì)胞中LHFPL3-AS1、miR-515-5p 表達(dá)

圖3 各組HGC-27/DDP 細(xì)胞中LHFPL3-AS1、miR-515-5p 表達(dá)

2.3 LHFPL3-AS1 靶向miR-515-5p

DIANA Tool 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)顯示LHFPL3-AS1 與miR-515-5p 序列之間存在特異結(jié)合位點(diǎn)，見圖4A。與wt-LHFPL3-AS1 共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染miR-515-5p mimic后 HGC-27/DDP 細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性與轉(zhuǎn)染miR-NC 比較顯著降低（P<0.05）；與mut-LHFPL3-AS1 共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染miR-515-5p mimic 與轉(zhuǎn)染miR-NC相比HGC-27/DDP 細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖4B。

圖4 LHFPL3-AS1 和miR-515-5p 的互補(bǔ)序列及熒光素酶活性檢測(cè)

2.4 各組HGC-27/DDP 細(xì)胞的增殖活性

si-LHFPL3-AS1 組HGC-27/DDP 細(xì)胞克隆形成數(shù)、存活率均顯著低于Con 組和si-NC 組（P<0.05）；miR-515-5p mimic 組HGC-27/DDP 細(xì)胞克隆形成數(shù)、存活率顯著低于miR-NC 組（P<0.05）；si-LHFPL3-AS1+miR-515-5p inhibitor 組HGC-27/ DDP 細(xì)胞克隆形成數(shù)、存活率顯著高于si-LHFPL3-AS1組（P<0.05），見表1。

表1 各組細(xì)胞的存活率、克隆形成數(shù)比較（±s）

表1 各組細(xì)胞的存活率、克隆形成數(shù)比較（±s）

注：與Con 組比較，*P<0.05；與si-NC 組比較，#P<0.05；與miR-NC 組比較，△P<0.05；與si-LHFPL3-AS1 組比較，▲P<0.05

2.5 各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力

si-LHFPL3-AS1組HGC-27/DDP細(xì)胞的E-cadherin蛋白表達(dá)顯著高于Con 組和si-NC 組（P<0.05），N-cadherin 蛋白表達(dá)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著低于Con組和 si-NC 組（P<0.05）；miR-515-5p mimic 組HGC-27/DDP 細(xì)胞的E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著高于miR-NC 組（P<0.05），N-cadherin 蛋白表達(dá)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著低于miR-NC 組（P<0.05）；si-LHFPL3-AS1+miR-515-5p inhibitor 組 HGC-27/DDP 細(xì)胞的E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著低于 si-LHFPL3-AS1 組（P<0.05），N-cadherin 蛋白表達(dá)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著高于si-LHFPL3-AS1 組（P<0.05），見圖5、表2。

表2 各組細(xì)胞的遷移、侵襲數(shù)比較（±s）

表2 各組細(xì)胞的遷移、侵襲數(shù)比較（±s）

注：與Con 組比較，*P<0.05；與si-NC 組比較，#P<0.05；與miR-NC 組比較，△P<0.05；與si-LHFPL3-AS1 組比較，▲P<0.05

圖5 各組細(xì)胞的遷移、侵襲和E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達(dá)

3 討論

順鉑耐藥是限制胃癌患者化療效果的重要因素，明確胃癌順鉑耐藥的機(jī)制將有助于開發(fā)新的治療策略提高胃癌化療敏感性。近年來，lncRNA 在胃癌化療耐藥中的作用受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌順鉑耐藥細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解聯(lián)蛋白金屬蛋白酶9 基因反義2（ADAMTS9-AS2）表達(dá)降低，其過表達(dá)可增強(qiáng)順鉑對(duì)耐藥細(xì)胞的毒性作用，抑制順鉑耐藥[8]。lncRNA NUTM2A-AS1 明顯增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的存活、侵襲和耐藥能力，促進(jìn)胃癌發(fā)生和耐藥[9]。敲減lncRNA 漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（plasmacytoma variant ectopic 1，PVT1）可抑制耐藥蛋白表達(dá)，抑制腫瘤生長，削弱胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[10]。本研究發(fā)現(xiàn)HGC-27/DDP 細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值高于親本細(xì)胞HGC-27，提示LHFPL3-AS1 表達(dá)改變可能與胃癌順鉑耐藥有關(guān)。轉(zhuǎn)染si-LHFPL3-AS1 干擾LHFPL3-AS1 表達(dá)可降低HGC-27/DDP 細(xì)胞存活率，并導(dǎo)致克隆形成、遷移和侵襲能力減弱。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移的先決條件，通過EMT 腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力[11]。先前的研究表明LHFPL3-AS1 在黑色素瘤中具有促增殖、促侵襲和促EMT 功能，E-cadherin 是上皮表型標(biāo)志物，其減少和丟失表明EMT 發(fā)生變化，同時(shí)間質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin 表達(dá)增加預(yù)示EMT 發(fā)生[12-13]。本研究中干擾LHFPL3-AS1 明顯抑制N-cadherin 蛋白表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin 蛋白表達(dá)。以上研究說明干擾LHFPL3-AS1 對(duì)HGC-27/DDP 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲均有抑制作用。

lncRNA 主要通過結(jié)合miRNA 在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)控作用[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)HGC-27 和HGC-27/DDP 細(xì)胞中miR-515-5p 相對(duì)水平低于GES-1，且證實(shí)LHFPL3-AS1 和miR-515-5p 存在相互作用。miR-515-5p 已被證實(shí)與胃癌生長和糖酵解有關(guān)[16]。miR-515-5p 作為LINC00673 的下游靶點(diǎn)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷移有抑制作用[17]。環(huán)狀RNA 0032821 通過下調(diào)miR-515-5p 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和奧沙利鉑耐藥[18]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-515-5p 過表達(dá)抑制N-cadherin 蛋白表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin 蛋白表達(dá)，降低HGC-27/DDP 細(xì)胞存活率、克隆形成、遷移和侵襲能力。抑制 miR-515-5p 表達(dá)還可減弱干擾LHFPL3-AS1 對(duì)HGC-27/DDP 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，這表明LHFPL3-AS1 至少通過靶向miR-515-5p調(diào)控HGC-27/DDP 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

總之，干擾LHFPL3-AS1 通過上調(diào)miR-515-5p可抑制胃癌細(xì)胞HGC-27/DDP 的增殖、遷移和侵襲。這些發(fā)現(xiàn)有助于改善胃癌細(xì)胞順鉑耐藥現(xiàn)狀，提示LHFPL3-AS1 和miR-515-5p 可能是克服胃癌順鉑耐藥的潛在有效靶點(diǎn)。