基于NF-κB 信號通路探討參麥注射液聯合大黃治療尿毒癥心肌病的研究

段學峰，蔣鉆紅，秦利強，徐光標，崔可

1.浙江省臺州醫(yī)院腎內科，浙江臨海 317000；2.浙江省臺州醫(yī)院重癥醫(yī)學科，浙江臨海 317000

據統計，我國每天新增約13 萬例尿毒癥患者[1]。尿毒癥心肌病是導致心血管疾病并發(fā)癥死亡的最主要原因[2]。迄今為止，尿毒癥引起心肌損害的發(fā)病機制尚未明確。在眾多尿毒癥毒素中，腸源性毒素對尿毒癥患者心血管系統的危害逐漸被研究者證實并重視，其中硫酸對甲酚和硫酸吲哚酚作為腸源性尿毒癥毒素的代表引起廣泛關注[3-4]。研究顯示，硫酸對甲酚和硫酸吲哚酚在尿毒癥患者體內蓄積不僅會加速腎臟纖維化，還可使內皮細胞活性氧增多，激活絲裂原激活蛋白激酶/核因子кB（nuclear factorкB，NF-кB）通路，導致炎癥反應進而損傷血管內皮細胞，并通過多種機制對患者的心血管系統造成損傷[5-6]。因此，基于NF-кB 通路研究尿毒癥心肌細胞的保護機制，可作為尿毒癥心肌病治療的突破點。本研究基于NF-кB 信號通路探討益氣降濁法治療尿毒癥心肌病的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用溫州醫(yī)科大學動物實驗中心提供的健康成年SPF 大鼠72 只，體質量（250±20）g，雌雄各半。本研究經浙江省臺州醫(yī)院動物實驗倫理委員會討論審議通過（倫理審批號：TZY-2022042）。

1.2 主要試劑

NF-кB p65 抗體購自美國Santacruz 公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒購自美國Sigma 公司。

1.3 藥物

參麥注射液（批準文號：國藥準字Z33020020，生產單位：正大青春寶藥業(yè)有限公司，規(guī)格：每支裝20ml），生大黃煎液：生大黃100g 配制成100ml 煎液。

1.4 實驗分組

SPF 大鼠72 只，雌雄各半，隨機分成6 組，即正常組、假手術組、模型組、益氣組、降濁組和益氣降濁組，每組12 只。

1.5 動物模型制備及分組

大鼠在手術前禁水8h、禁食12h。10%水合氯醛腹腔麻醉，取俯臥位并固定。消毒、備皮，在脊柱旁0.5cm 與右肋下1cm 交接位置做一切口，暴露右腎，結扎右腎門腎蒂，切除右腎，之后右腎稱重。手術7d 后，按前述手術方式暴露左側腎臟，分離左腎周圍脂肪囊切除腎包膜，分別于腎臟上端和下端楔形切除1/3 左腎組織，重量為右腎重量的2/3。手術切口使用海綿明膠按壓止血后縫合，送回單獨飼養(yǎng)。假手術組只需完成雙側腎臟周圍脂肪囊分離及切除雙腎包膜。所有大鼠在手術后連續(xù)注射青霉素3d。術后禁食24h，不禁水。使用無創(chuàng)尾動脈血壓測量儀測量大鼠尾動脈收縮壓。每天均于9:00-16:30測量，共計測量5 次，最后取平均值。

隨機選擇兩組大鼠，分別于手術后2、8、16、24、30、36 周時，收集其24h 尿液。之后使用乙醚麻醉，采集其眼眶血檢測血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，Scr），確定大鼠尿毒癥模型是否創(chuàng)建成功。造模成功后，降濁組大鼠給予生大黃煎液1ml/100g 灌胃，每天1次，持續(xù)1 周；益氣降濁組大鼠給予生大黃煎液1ml/100g 灌胃，每天1 次，皮下注射參麥注射液1ml/200g，每天1 次，持續(xù)1 周；益氣組大鼠皮下注射參麥注射液1ml/200g，每天1 次，持續(xù)1 周；模型組大鼠和假手術組大鼠給予1ml/100g 生理鹽水灌胃，每天1 次，持續(xù)1 周。正常組大鼠不作任何處理。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 大鼠心臟重量指數 完成最后一次治療后，禁食，不禁水，處死大鼠，稱取大鼠心臟重量和左心室重量，計算左心室重量指數（左心室重量/體質量）和心臟重量指數（心臟重量/體質量）。

1.6.2 血標本檢測 水合氯醛麻醉大鼠，股靜脈采血，酶聯免疫吸附測定法檢測血清樣本中TNF-α、IL-6 水平。具體操作根據試劑盒說明書進行。

1.6.3 心肌組織病理學檢測 分離心臟，沿大鼠心尖部縱向對半切開，取一半心肌組織迅速放入10%甲醛溶液中固定，送病理室，剩余心肌組織液氮中保存。將制備好的心肌組織脫蠟水化，分別進行Masson 染色、蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE 染色）。

1.6.4 心肌NF-κB p65 蛋白表達檢測 采用蛋白質印跡法檢測心肌NF-κB p65 蛋白相對表達量，具體操作包括制膠、樣品處理、加樣與電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、蛋白檢測。

1.7 統計學方法

采用SPSS 24.0 統計軟件對數據進行分析處理。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的左心室重量指數與心臟重量指數比較

模型組大鼠的左心室重量指數和心臟重量指數均顯著高于正常組（P<0.05）。益氣降濁組大鼠的左心室重量指數和心臟重量指數均顯著低于模型組、益氣組、降濁組、假手術組（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠的左心室重量指數與心臟重量指數比較（±s）

表1 各組大鼠的左心室重量指數與心臟重量指數比較（±s）

注：與益氣降濁組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05

2.2 各組大鼠的心肌組織HE 染色

正常組大鼠心肌組織分布均勻，細胞排列整齊，肌纖維走行相同，可見少量成纖維細胞；模型組大鼠心肌排列欠規(guī)則，呈波浪、松散狀，細胞形態(tài)模糊，成纖維細胞明顯增加，合并炎癥細胞浸潤；假手術組與模型組較為相似；益氣組、降濁組、益氣降濁組心肌組織均有顯著變化，益氣降濁組大鼠心肌纖維走行相同，且心肌組織分布均勻性、細胞排列整齊度均優(yōu)于益氣組和降濁組，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織（HE 染色，×200）

2.3 各組大鼠的心肌組織Masson 染色

大鼠膠原纖維為藍色、肌纖維為紅色。正常組大鼠心肌纖維整齊，少量膠原纖維均勻分布于心肌間質；模型組大鼠心肌膠原纖維明顯增多，排列紊亂，有心肌纖維化表現；假手術組大鼠心肌膠原纖維稍有變化，心肌膠原沉積輕微減少，排列不均勻；益氣組、降濁組、益氣降濁組大鼠心肌膠原沉積均明顯減少，心肌纖維整齊，益氣降濁組變化最為明顯，見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織（Masson 染色，×200）

2.4 各組大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表達水平比較

模型組大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表達水平均顯著高于正常組（P<0.05）；益氣降濁組大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表達水平低于模型組、益氣組、降濁組、假手術組（P<0.05），見表2。

表2 各組大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表達水平比較（±s）

注：與益氣降濁組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05

3 討論

尿毒癥是各種腎臟疾病發(fā)展的終末階段，可増加心血管疾病的發(fā)生率和病死率[7]。尿毒癥患者臨床表現為胸悶、胸痛、心悸、呼吸困難等，多伴有心肌肥厚、心臟擴大、心輸出量減少，重者出現充血性心力衰竭、猝死[8-9]。心肌病在中醫(yī)屬真心痛、心悸、胸痹等范疇；尿毒癥在中醫(yī)屬腎風、虛勞、水腫、癃閉、關格范疇，是毒、熱、瘀、濕、飲共同作用的結果。參麥注射液聯合大黃是治療尿毒癥心肌病的有效手段之一。參麥注射液主要成分為麥冬、紅參，具有養(yǎng)陰生津、益氣固脫之功效，可用于治療氣陰兩虛的疾病，如肺心病、病毒性心肌炎、冠心病等。紅參可增強心肌對缺氧的耐受力，對心肌細胞DNA 合成有促進作用。同時還可調節(jié)心肌組織血流量，有效保護受損的心肌超微結構。人參皂苷是紅參的有效成分之一，可抑制血栓烷A2，進而擴張血管，減少心臟負荷，緩解心肌缺血。麥冬具有穩(wěn)定心肌細胞膜、正性肌力作用。參麥注射液可抑制平滑肌細胞膜Na+-K+-ATP 酶活性，對Na+-Ca2+與Na+-K+轉換產生影響，增加內流的Ca2+，以提升心肌收縮功能，降低周圍血管阻力、減少心肌耗氧，調節(jié)心肌能量代謝，增加缺血心肌能源儲備，清除氧自由基，有效保護心肌。臨床研究顯示，參麥注射液治療嚴重心功能不全患者能夠改善心功能，提高心肌收縮力，有直接正性肌力作用[10]。參麥注射液可下調Bax 蛋白表達，減少心肌細胞凋亡，對心肌細胞起保護作用[11]。除注重心肌細胞的保護外，也要重視患者毒素的排泄，其中生大黃具有清熱解毒、通里攻下、活血化瘀的作用。可有效清除胃腸內細菌、毒素，活血化瘀，調節(jié)微循環(huán)，加速新陳代謝[12]。大黃性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血瀉火、逐瘀通經的功效。現代藥理學研究顯示，大黃可在一定程度上改善與保護血液流變學、凝血功能，具有抗心律失常、強心、抗心肌缺血、抗血管痙攣、保護心肌、抗動脈粥樣硬化、降血壓、清除氧自由基等多重功效。大黃酸是大黃的成分之一，研究顯示大黃酸可改善過氧化氫誘導的心肌細胞損傷。多項臨床研究顯示大黃提取物大黃素用于急性心肌梗死患者，可保護心功能，減少梗死面積，還可在一定程度上抑制炎癥反應[13-14]。研究發(fā)現，參麥注射液聯合大黃可顯著降低左心室重量指數與心臟重量指數，對心臟結構變化有改善作用[15]。

研究發(fā)現TNF-α、IL-6 能激活絲裂原激活蛋白激酶信號通路并誘導其下游轉錄因子蛋白家族活化，進而誘發(fā)心肌肥厚、促進膠原合成，最終損傷心肌[16]。近年來研究證實，在感染、創(chuàng)傷、毒素等因素的剌激下，活化的細胞因子扮演信使的作用，激活心肌細胞的抑制物質，最終導致心臟功能受損[17]。本研究結果提示尿毒癥心肌病模型大鼠炎癥反應明顯，TNF-α、IL-6 水平升高，而益氣降濁法能明顯緩解炎癥反應，進而避免過度激活TNF-α、IL-6。研究證實，炎癥細胞因子與NF-кB 調控作用密切相關。調控NF-кB 的重要蛋白之一為IκB-α。藥理學研究發(fā)現，尿毒癥心肌病能夠擾亂細胞調節(jié)能力，并影響信號通路系統，器官細胞的NF-кB 下調與機體的炎癥反應強度減弱有關[18]。應用參麥注射液后，IκB-α 表達上調，減少TNF-α 的生成與釋放，說明對NF-кB 信號傳導路徑進行調節(jié)能抑制炎癥反應，進而保護機體細胞。本研究HE 染色、Masson 染色結果提示，模型大鼠心肌組織炎癥細胞浸潤、間質纖維化、細胞壞死，益氣降濁法可減輕心肌損傷、改善心肌纖維化。

綜上所述，尿毒癥可通過NF-кB 信號通路過度激活而誘發(fā)心肌損傷，參麥注射液聯合大黃能抑制該信號通路過度激活，緩解炎癥反應，保護心肌細胞，預防尿毒癥心肌病。