miRNA-455- 3 p在乳腺癌組織中的表達及與紫杉醇耐藥的關系△

嵇曉輝，姜麗娜，王娜，劉薇，楊金花#

鄭州人民醫院1病理科，2乳腺外科，鄭州 450003

乳腺癌屬于多基因異質性惡性腫瘤，在女性中 其發病率僅次于宮頸癌，且近年來其發病呈逐漸年輕化的趨勢，對女性身心健康的影響極大，發病后患者多會出現胸痛、乳頭內陷、乳頭破碎等癥狀，早期多采用根治性手術治療[1]。但由于乳腺癌早期臨床癥狀無特異性，多數患者確診時病情已進展至中晚期，錯過了最佳的手術時機，只能依靠化療穩定病情[2]。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是常用的乳腺癌化療藥物，該藥物具有促進微管蛋白聚合、抑制解聚的作用，可確保微管蛋白處于穩定狀態，避免細胞有絲分裂，與靶向藥物聯合應用還能在減輕不良反應的同時提高治療效果，長期治療雖然能在一定程度上增加腫瘤細胞的敏感性，但也有可能產生較大的毒性[3]。因此，盡早明確乳腺癌的耐藥機制，研發新型靶向治療藥物，在提高藥物敏感性的同時減輕不良反應，才能保障整體治療效果[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）作為保守的內源性非編碼小RNA，其組織特異性較高，目前已有研究認為miRNA-455-3p能夠調控腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性[5]。此外，自噬相關蛋白12（autophagy related 12，ATG12）在多種惡性腫瘤中異常表達，與惡性腫瘤靶向治療耐藥存在一定關聯，但在乳腺癌中的研究較少。基于此，本研究探討乳腺癌組織中miRNA-455-3p的表達及與PTX耐藥的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月至2021年7月鄭州人民醫院收治的乳腺癌患者。納入標準：①符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范（2015版）》[6]中乳腺癌的診斷標準；②經病理檢查確診為乳腺癌，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期；③臨床資料完整。排除標準：①對PTX過敏；②存在化療禁忌證；③合并其他器官感染或腫瘤；④認知功能障礙，無法完全配合治療；⑤接受過化療或放療。依據納入和排除標準，本研究共納入80例乳腺癌患者，年齡30～78歲，平均（54.41±5.62）歲；病程1～6年，平均（3.21±0.46）年；PTX敏感者40例，PTX耐藥者40例；TNM分期：Ⅲ期60例，Ⅳ期20例。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA的表達水平

取80例乳腺癌患者的乳腺癌組織和相應癌旁組織，PTX耐藥和PTX敏感乳腺癌患者的乳腺癌組織，液氮中冷凍，隨后迅速置于-80℃冰箱中保存待檢。采用Trizol法提取組織樣品中的總RNA，然后采用miRNA反轉錄試劑盒合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），并以cDNA作為模板，利用Primer 5設計引物，配制PCR反應體系，最后于熒光定量PCR儀上對miRNA-455a-3p表達水平進行檢測，重復測量3次取平均值，以U6為內參，采用 2-△△Ct法計算 miRNA-455-3p 的相對表達量。miRNA-455-3p正向引物：5'-CGTCGAAGAAGGGCAAGTAG-3'，反向引物：5'-CACCATTCCAAGCACAACAC-3'；U6正 向 引 物 ：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，采用 2-△△Ct法計算 PTX 耐藥和PTX敏感乳腺癌患者乳腺癌組織中ATG12mRNA的相對表達量。ATG12正向引物：5'-CTGCTGCGGCGGGCGAGAG-3'，反向引物：5'-GGGCGAAACTGCAACCGAAGACG-3'；GAPDH正向引物：5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，反向引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3'。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養和分組采用含有300 μg/ml PTX的RPMI-1640培養液培養人乳腺癌MCF-7細胞，24 h后更換為不含PTX的RPMI-1640培養液，一旦細胞融合度高達70%，則反復使用PTX誘導，并反復換液、傳代，24周后建立PTX耐藥細胞MCF-7/PTX。將MCF-7/PTX接種于96孔板中，1×105/孔，待細胞融合度達到50%，采用Lipofectamine 3000將miRNA-NC、miRNA-455-3p mimics分別轉染至乳腺癌耐藥MCF-7/PTX細胞，分別作為miRNANC組、miRNA-455-3p組。

1.3.2 蛋白質印跡法（Western blot）檢測相關蛋白的相對表達量將細胞裂解液加入待裂解細胞中后，離心取上清液，并采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白對試劑盒中的蛋白質濃度進行測定，吸取50 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），隨后于100 V恒壓條件下將蛋白印跡轉移到纖維素膜中，于4℃條件下采用5%脫脂牛奶封閉纖維素膜，并孵育過夜，隨后加入P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、谷胱甘肽 S-轉移酶-π（glutathione S-transferase-π，GST-π）一抗，室溫下孵育2 h，采用TBST洗滌；加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1.5 h，隨后采用電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）法對蛋白進行檢測，同時利用Image Scanner軟件分析P-gp、GST-π蛋白的相對表達量。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡能力將細胞接種于6孔培養板中孵育24 h，1×105/孔，PTX處理后繼續培養48 h。胰蛋白酶消化細胞后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌重懸，隨后取 100 μl細胞懸液加入 5 μl膜聯蛋白 V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）孵育 10 min，然后加入 5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）孵育15 min，采用流式細胞儀和Flowjo軟件計算細胞凋亡率。

1.4 觀察指標

①比較乳腺癌組織和癌旁組織中miRNA-455-3p的相對表達量。②比較PTX耐藥和PTX敏感乳腺癌患者乳腺癌組織中miRNA-455-3p、ATG12mRNA的相對表達量。③比較miRNA-NC組、miRNA-455-3p組MCF-7/PTX細胞的凋亡率以及P-gp、GST-π蛋白的相對表達量。④分析乳腺癌組織miRNA-455-3p的表達與ATG12表達的相關性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對所有數據進行統計分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織和癌旁組織中miRNA-455- 3 p相對表達量的比較

乳腺癌組織中miRNA-455-3p的相對表達量為（1.01±0.03），明顯高于癌旁組織的（0.73±0.03），差異有統計學意義（t=59.029，P＜0.01）。

2.2 PTX敏感和PTX耐藥乳腺癌患者乳腺癌組織中miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA相對表達量的比較

PTX敏感乳腺癌患者乳腺癌組織中miRNA-455-3p的相對表達量明顯高于PTX耐藥患者，ATG12mRNA相對表達量明顯低于PTX耐藥患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 PTX敏感和PTX耐藥乳腺癌患者乳腺癌組織中miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA相對表達量的比較（±s）

表1 PTX敏感和PTX耐藥乳腺癌患者乳腺癌組織中miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA相對表達量的比較（±s）

PTX耐藥情況PTX敏感（n=40）PTX耐藥（n=40）t值P值1.02±0.02 0.68±0.04 48.083 0.000 0.63±0.08 1.29±0.12 28.943 0.000 miRNA-455-3p ATG12 mRNA

2.3 miRNA-455- 3 p過表達對乳腺癌細胞MCF- 7/PTX凋亡情況及P-gp、GST- π蛋白相對表達量的影響

miRNA-455-3p組細胞凋亡率明顯高于miRNANC組，P-gp、GST-π蛋白相對表達量均明顯低于miRNA-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 miRNA-455- 3 p組和miRNA-NC組MCF- 7/PTX細胞凋亡情況及P-gp、GST-π蛋白相對表達量的比較（±s）

表2 miRNA-455- 3 p組和miRNA-NC組MCF- 7/PTX細胞凋亡情況及P-gp、GST-π蛋白相對表達量的比較（±s）

組別miRNA-NC組miRNA-455-3p組t值P值8.41±0.42 16.84±0.52 56.401 0.000 1.06±0.11 0.46±0.06 21.415 0.000 1.02±0.08 0.47±0.05 26.073 0.000凋亡（%）P-gp蛋白GST-π蛋白

2.4 miRNA-455- 3 p表達與ATG12表達的相關性

Spearman相關分析結果顯示，乳腺癌組織中miRNA-455-3p的表達與ATG12的表達呈負相關（r=-0.697，P＜0.01）。

3 討論

乳腺癌的發病機制較為復雜，目前臨床尚未完全明確，可能與遺傳、外源性雌激素刺激、不良生活習慣等因素有關[7]。化療作為乳腺癌常見的輔助治療方法之一，以PTX最為常見，該藥可有效抑制病情進展，治療效果顯著，但若患者對PTX產生耐藥性，極有可能增加化療失敗、腫瘤轉移的風險，甚至還有可能縮短患者的生存期，嚴重影響患者的預后[8]。因此，臨床只有盡早明確乳腺癌組織產生PTX耐藥的原因，才能及時采取有效的措施進行干預，進而降低乳腺癌組織對PTX的耐藥性，達到提高患者臨床治療效果的目的[9]。

miRNA含有20～24個核苷酸，可通過與靶基因3'-非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）完全或不完全結合的方式對靶基因和蛋白翻譯功能進行降解和抑制，使miRNA調控信號通路出現異常[10]。目前已有研究證實，腫瘤內的miRNA與化療藥物的耐藥性存在一定關聯[11]。miRNA-455-3p是功能性miRNA的一種，可在多種惡性腫瘤耐藥性的產生過程中發揮調控作用，但miRNA-455-3p對乳腺癌PTX耐藥的影響及其調控機制仍有待進一步研究[12]。目前也有研究認為自噬與腫瘤細胞耐藥性存在一定關聯，ATG12作為自噬小體形成的主要參與因子之一，可誘導自噬小體的形成促進自噬的發生，自噬的發生能夠誘導腫瘤細胞對治療的抵抗[13-14]。相關研究認為，miRNA可在調控ATG12的表達后，直接參與腫瘤耐藥性的產生過程[15-16]。本研究也認為miRNA-455-3p與ATG12的表達存在關聯，與癌旁組織相比，乳腺癌組織中miRNA-455-3p的相對表達量明顯更高，且PTX敏感組織中miRNA-455-3p的相對表達量明顯高于PTX耐藥組織，而ATG12mRNA的相對表達量明顯低于PTX耐藥組織。提示ATG12可能是miRNA-455-3p的潛在靶基因之一，且ATG12還可能在PTX的作用下對耐藥細胞的自噬和凋亡產生影響，從而干擾miRNA-455-3p的表達，增強乳腺癌的耐藥性。

P-gp蛋白作為多藥耐藥基因編碼的產物，可將PTX泵出細胞外，同時還能對腫瘤細胞的生長、凋亡產生調節作用[17-18]。GST-π蛋白可使細胞毒性藥物參與到化療中，使化療耐藥，而下調P-gp和GST-π蛋白的表達可逆轉乳腺癌細胞的耐藥性，抑制P-gp和GST-π蛋白的表達還能有效逆轉miRNA-455-3p對MCF-7/PTX細胞凋亡的影響[19-20]。本研究結果顯示，miRNA-455-3p組細胞凋亡率明顯高于miRNA-NC組，P-gp、GST-π蛋白的相對表達量均明顯低于miRNA-NC組，提示miRNA-455-3p高表達可能抑制了乳腺癌PTX的耐藥過程，干擾miRNA-455-3p的表達可能增強乳腺癌組織的耐藥性。但本研究僅為單中心研究，且樣本量較少，后續還需要加大樣本量，并進行多中心分析，才能進一步提高研究結果的真實性和可靠性。

綜上所述，乳腺癌組織中miRNA-455-3p表達與PTX耐藥存在一定關聯，miRNA-455-3p能夠靶向抑制ATG12的表達，降低耐藥乳腺癌細胞的自噬活性，促進細胞迅速凋亡，最終改善乳腺癌細胞對PTX的敏感性。