自制海鹿復方治療實驗小鼠再生障礙性貧血的藥效學研究

王利群，文金全，劉延河，孫武霞，張寶娟，李 飛，羅 燕

﹝咸陽彩虹醫院（咸陽市兒童醫院）1.中醫兒科 2.小兒血液科，陜西 咸陽 712000﹞

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一組以骨髓有核細胞增生減低和全血細胞減少，但無異常細胞浸潤或骨髓纖維化為特征的骨髓衰竭性疾病[1]。目前AA 的藥物治療仍有一定的局限性，非骨髓移植治療主要是使用免疫抑制劑[2]，但難以達到血液學的持續緩解及治愈目標，且不良反應多，而將西藥與中藥聯合應用可取得很好的療效[3-4]。海鹿復方是筆者根據AA 的發病機制及中醫組方規律研制而成的，臨床用于治療兒童AA 二十余年，取得了滿意療效。本研究以BALB/c 小鼠建立AA 動物模型，探討應用海鹿復方等藥物治療小鼠AA 模型對其體重、白細胞、紅細胞、血小板、網織紅細胞、白細胞介素-4（IL-4）、γ- 干擾素（IFN-γ）、輔助性T 細胞1（Th1）、輔助性T 細胞2（Th2）的影響，為本制劑的臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

BALB/c 小鼠80 只，8 ～12 周齡，體重18 ～22 g，清潔級，雌雄各半，實驗在西安交通大學動物實驗中心進行。采用隨機分組法分為8 組：1）空白對照組；2）模型組；3）單純海鹿復方小劑量組；4）單純海鹿復方大劑量組；5）黃芪當歸組；6）司坦唑醇+ 左旋咪唑（早期治療AA 的方案）組；7）海鹿復方+司坦唑醇+左旋咪唑（早期中西醫結合治療方案）組；8）陽性組：環孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑（目前治療AA 的常用方案）組。每組10 只活小鼠。

1.2 藥物

1）苯：分析純，由天津市富宇精細化工有限公司生產，批號：20160305。2）檢測IL-4、IFN-γ、Th1、Th2試劑，商用試劑盒。3）海鹿復方：鹿茸、海馬、西洋參等粉碎，過80 目篩；黃芪、當歸等煎藥后分袋包裝50 mL，按含生藥2 g/mL 放置于冰箱備用。以上中藥由陜西省醫藥公司提供。4）主要儀器：血細胞分析儀：SYsmex-500i，由希森美康醫用電子有限公司生產。

1.3 實驗方法

將小鼠按性別及體重隨機分為8 組（每組10 只）分籠群養，適應飼養1 周后開始建模。按刑海燕等[5]成功建模的方法，將苯劑以2 mL/kg 劑量注射于BALB/c小鼠尾根皮下，每周4 次，共20 次。建模成功后開始治療給藥，空白對照組灌胃生理鹽水0.4 mL/10 g，其余各組藥物亦按此容積灌胃給藥，分別按人和動物的等效劑量（人用量的12 倍）分組給藥治療（海鹿復方小劑量組給藥劑量0.4 g/kg，海鹿復方大劑量組給藥劑量4 g/kg）。治療周期為10 d。于最后一次給藥2 h后處理動物。眼球取血等量注入2 管中分別行血常規檢查、網織紅細胞檢測及IL-4、IFN-γ、Th1、Th2檢測。IL-4、IFN-γ、Th1及Th2細胞因子的檢測方法：采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測，嚴格按試劑盒說明書的操作流程加血清及試劑反應，以酶標儀檢測結果。

1.4 觀察指標

觀察建模后AA BALB/c 小鼠的存活情況。觀察海鹿復方對AA BALB/c 小鼠體重的影響。觀察海鹿復方對AA BALB/c 小鼠血液學指標的影響，血液學指標包括白細胞、紅細胞、血小板和網織紅細胞。觀察海鹿復方對AA BALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2的影響。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對實驗數據進行分析，計量資料以±s表示，行t檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 海鹿復方對AABALB/c 小鼠體重的影響

模型建成后開始給藥，連續給藥10 d，動物表現為活動基本正常，體重增加，毛色恢復光亮，大、小便正常，無死亡現象。由表1 可見，模型組體重明顯低于空白對照組，P＜0.01；各治療組（除環孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑組）體重均高于模型組，P＜0.01。前者證明建立小鼠AA 模型成功，后者提示治療后改善了小鼠的體重。

表1 海鹿復方對AA BALB/c 小鼠體重的影響（g，± s）

表1 海鹿復方對AA BALB/c 小鼠體重的影響（g，± s）

注：與模型組比較，★P ＜0.05，★★P ＜0.01；與空白對照組比較，※P＜0.05，※※P ＜0.01；當時為節省費用，未做海鹿復方大劑量組與體重間關系的研究。

組別 動物數（N）體重空白對照組 10 26.20±2.82★★模型組 10 16.00±1.79※※海鹿復方小劑量組 10 20.60±4.86★★※※黃芪當歸組 10 20.10±3.22★★※※司坦唑醇+左旋咪唑組 10 20.40±4.45★★※海鹿復方+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 19.10±2.71★※※環孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 18.20±2.33※※

2.2 海鹿復方對AABALB/c 小鼠血液學指標的影響

模型組小鼠三系減少，網織紅細胞減少，與對照組相比，P＜0.01，證明建模成功。各治療組血液中白細胞計數與模型組比較均顯著增加，P＜0.01，其中尤以海鹿復方+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組、海鹿復方大劑量組白細胞升高最為顯著，而黃芪當歸組、環孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組白細胞升高相對較差，但與其他治療組比較無統計學差異（P＞0.05），提示應用海鹿復方治療AA 的效果優于目前通用的環孢素A+ 司坦唑醇治療方法。各治療組血液中血小板計數與模型組相較均顯著增加，P＜0.01，其中尤以司坦唑醇+ 左旋咪唑組、海鹿復方大劑量組及海鹿復方+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組血小板升高最為顯著，而黃芪當歸組、環孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組血小板升高相對較差。各治療組血液中網織紅細胞計數與模型組相較均顯著增加，P＜0.01（僅黃芪當歸組P＜0.05），其中尤以環孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組、司坦唑醇+ 左旋咪唑組、海鹿復方大、小劑量組為著。提示海鹿復方具有良好的促進AA 小鼠造血的作用。各組間紅細胞計數變化不大，主要是由于紅細胞生存時間長，短期內未顯現所致。詳見表2。

表2 海鹿復方對AA BALB/c 小鼠白細胞、紅細胞、血小板及網織紅細胞的影響（± s）

表2 海鹿復方對AA BALB/c 小鼠白細胞、紅細胞、血小板及網織紅細胞的影響（± s）

注：與模型組比較，★P＜0.05，★★P ＜0.01 ；與對照組比較，※P ＜0.05，※※P ＜0.01。

網織紅細胞計數（×109/L）空白對照組 10 7.53±0.64★★ 13.04±0.54 699.90±141.08★★ 0.0145±0.0071★★模型組 10 2.54±0.65 ※※ 8.24±1.34※※ 312.70±117.05※※ 0.0046±0.0021※※海鹿復方小劑量組 10 7.62±2.12★★ 10.46±0.84 592.10±196.83★★ 0.0133±0.0068★★海鹿復方大劑量組 10 8.24±1.62★★ 11.45±0.24 613.20±112.52★★ 0.0156±0.0054★★黃芪當歸組 10 6.53±2.01★★ 11.20±0.55 452.30±141.36★★ 0.0120±0.00582★司坦唑醇+左旋咪唑組 10 8.20±1.94★★ 10.06±0.42 770.60±111.60★★ 0.0219±0.0092★★海鹿復方+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 9.03±2.63★★※ 12.40±0.60 603.90±109.23★★ 0.0088±0.0016★★環孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 6.92±1.39★★ 11.98±1.20 579.50±141.15★★ 0.0279±0.0113★★※※組別 動物數（N）白細胞計數（×109/L）紅細胞計數（×1012/L）血小板計數（×109/L）

2.3 海鹿復方對AABALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2 的影響

IL-4、INF-γ、Th1、Th2檢 測 結果：模 型 組INF-γ、Th1均高于空白對照組，IL-4、Th2均低于空白對照組，P＜0.05。提示模型建立成功。各治療組INF-γ、Th1均低于模型組，IL-4、Th2均高于模型組，P＜0.05，其中尤以司坦唑醇+ 左旋咪唑組、黃芪當歸組、海鹿復方大、小劑量組IL-4 升高、INF-γ 降低最為顯著。詳見表3。

表3 海鹿復方對AA BALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2 的影響（± s）

表3 海鹿復方對AA BALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2 的影響（± s）

注：與模型組比較，★P ＜0.05，★★P ＜0.01 ；與對照組比較，※P ＜0.05，※※P ＜0.01。

組別 動物數（N）IL-4（pg/mL） IFN-γ（pg/mL） Th1（ng/L） Th2（ng/L）空白對照組 10 131.68±4.57 610.99±19.88 69.63±3.55★★ 58.93±1.47★★模型組 10 55.42±5.00※※ 653.31±26.43※ 81.56±3.34※※ 30.94±2.81※※海鹿復方小劑量組 10 105.54±10.87★★※※ 471.47±52.22★★※※ 64.67±7.04★★ 36.22±5.05★★海鹿復方大劑量組 10 114.51±11.35★※※ 466.23±35.62★★※※ 55.52±8.12★★※※ 40.15±4.28★★黃芪當歸組 10 118.62±8.62★★※※ 456.32±50.36★★※※ 61.45±8.12★★ 42.16±4.21★※司坦唑醇+左旋咪唑組 10 138.63±10.14※※ 435.98±45.15★★※※ 43.39±5.98※※ 45.61±1.31★※※海鹿復方+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 91.36±8.97★★※※ 573.68±13.95★※ 58.53±2.12★★ 43.86±2.59★★※※環孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑組 10 86.66±7.85★★※ 550.82±23.80★※ 61.26±3.24★★ 45.39±1.49★★※※

3 討論

AA 的主要發病機制目前多認為與免疫異常、造血干細胞及造血微環境受損有關。本病屬于中醫學中“血證”“虛勞”等范疇，主要由于六淫、七情、飲食不節、邪毒等傷及氣血臟腑，氣虛血虛，陰陽失調，尤其影響到脾、腎及骨髓功能，漸至元氣虧損，精血虛少，氣血生化不足所致。其病機以“腎虛”為本，以“血虛”為標。我國傳統醫學在治療AA 方面具有獨特的優勢。中醫認為，鹿茸、海馬為補腎中藥，用于治療AA 主要是基于腎主骨、骨生髓的中醫理論基礎?，F代藥理學研究顯示，鹿茸、海馬中均含有蛋白多肽類成分、氨基酸、無機元素、糖類、生物胺類、甾體類及脂類等成分[6-7]，具有性激素樣作用及免疫促進作用[7-8]；海馬對羥基脲所造成的腎陽虛小鼠有明顯的治療作用[9]，可增加雌二醇致腎陽虛小鼠紅細胞數量、血紅蛋白濃度及血小板數量[10]。有報道指出，活性鹿茸可抵抗昆明小鼠環磷酰胺所致骨髓抑制及體重減輕[11]，鮮活鹿茸治療腫瘤化療后骨髓抑制有效[12]。這符合AA 的免疫發病機制及臨床用雄性激素治療AA 有效的依據。

免疫機制是AA 發病研究的熱點，免疫抑制劑環孢霉素A 及抗淋巴細胞球蛋白對AA 治療有效是有力的證據，臨床治療重型AA 的有效率達75% ～80%[13]。揭示免疫功能及免疫細胞的活化，產生大量的造血負調控因子IFN-γ 及腫瘤壞死因子-α，尤其是IFN-γ 增高對造血的影響更大[14]，而造血的正調控因子IL-4 減少，前者由Th1細胞分泌，后者由Th2細胞分泌。本組實驗顯示，各治療方法均可降低AA 小鼠血液中INF-γ、Th1的含量，增加IL-4、Th2的含量，這與再障飲對AA 模型小鼠造血細胞的影響[15]結果一致。本組尤以司坦唑醇+ 左旋咪唑組、黃芪當歸組、海鹿復方大、小劑量組促使IL-4 升高、對INF-γ 降低作用較強，且作用程度超過陽性組環孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑組。這提示海鹿復方及黃芪、當歸不僅具有增強免疫功能[7-8]的作用，還具有免疫調節作用，提示海鹿復方及黃芪、當歸等是治療AA 適當、合理的組方。

本實驗顯示，海鹿復方能增加AA 小鼠的體重，改善其生存質量；海鹿復方能增加AA 小鼠白細胞、血小板、網織紅細胞的數量；海鹿復方能增加AA 小鼠外周血中Th2及IL-4 的含量，降低外周血中Th1及IFN-γ 的含量。海鹿復方可作為AA 的一種新的治療藥物。