澳洲堅(jiān)果生理落果期果柄離區(qū)形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞壁相關(guān)酶活性分析

李穆 李菊馨 曾黎明 黃錦媛 唐圣理 趙淵

摘? 要：對(duì)比分析澳洲堅(jiān)果早期生理落果期間正常果與脫落果果柄離區(qū)的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁相關(guān)酶活性，為落果生理基礎(chǔ)研究及生產(chǎn)上制定保果調(diào)控措施提供理論依據(jù)。通過制作石蠟切片觀察果柄離區(qū)的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，采用生化微量法分別測(cè)定盛花后30 d、40 d、50 d果柄離區(qū)中纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶的活性并分析其差異性。結(jié)果表明，正常果果柄表皮細(xì)胞排列緊密，無離層區(qū)域，而脫落果果柄具有明顯的離層區(qū)域，離層由2～3層大體積、橢圓形的細(xì)胞松散排列組成，細(xì)胞間隙較大，木質(zhì)化程度高于周圍組織細(xì)胞；在澳洲堅(jiān)果早期生理落果期間，脫落果果柄離區(qū)中纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶活性均顯著高于正常果果柄。研究結(jié)果表明，果柄離層木質(zhì)化程度、纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶等細(xì)胞壁相關(guān)酶活性變化是造成澳洲堅(jiān)果早期生理落果的重要因素。

關(guān)鍵詞：澳洲堅(jiān)果;離區(qū);果柄；纖維素酶;多聚半乳糖醛酸酶

中圖分類號(hào)：S664.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Analysis of Morphological Structure and Cell Wall-Related Enzyme Activity in Carpopodium Abscission Zone of Macadamia during the Physiological Nut-Drop Period

LI Mu， LI Juxin， ZENG Liming， HUANG Jinyuan， TANG Shengli， ZHAO Yuan*

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China）

Abstract： The morphological structure and cell wall-related enzyme activity in carpopodium abscission zone of normal and dropped macadamia nuts in the early physiological nut-drop period were compared for theoretical basis on physiological research of nut and the formulation of nut preservation control measures in production. Paraffin section was used to observe the morphological structure of carpopodium abscission zone of macadamia. The activity of cellulase and polygalacturonase enzymes in carpopodium abscission zone of macadamia on 30 d， 40 d and 50 d after flowering were tested by biochemical micromethod and their differences were analyzed. The results showed that the epidermal cells of the normal carpopodium were tightly arranged without the abscission zone， while the carpopodium of dropped nuts had obvious abscission zone. The abscission zone was composed of 2-3 large and elliptical cells that were loosely arranged， with larger cell gap and higher lignification degree than the surrounding tissue cells. During the early physiological nut-drop period， the activity of cellulase and polygalacturonase in carpopodium of dropped nuts were significantly higher than those in normal macadamia nuts. The results shows that the lignification degree of carpopodium abscission zone and the activity change of cell wall-related enzyme such as cellulase and polygalacturonase are the important factors causing the early physiological nut drop of macadamia.

Keywords： Macadamia; abscission zone; carpopodium; cellulase; polygalacturonase

果樹落花落果是一種較為普遍的現(xiàn)象，嚴(yán)重的落花落果會(huì)導(dǎo)致果樹產(chǎn)量下降[1]。造成果樹落花落果的直接原因是細(xì)胞壁降解松弛后致使離區(qū)細(xì)胞分離，從而引起果實(shí)脫落[2]。許多研究表明，纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶是植物細(xì)胞壁的兩種主要降解酶，參與植物離層細(xì)胞的降解過程，前者主要降解植物細(xì)胞壁中的纖維素成分，后者則主要降解細(xì)胞壁中的果膠成分[3-5]。在柑橘、龍眼等果樹中的研究表明，幼果脫落時(shí)纖維素酶活性均與落果率呈顯著的正相關(guān)[6-8]。在桃、梨、荔枝等果樹中的研究表明，多聚半乳糖醛酸酶在器官脫落中起著重要的作用[4，9，10]。

澳洲堅(jiān)果（Macadamia spp.）是一種原產(chǎn)于澳大利亞的高檔堅(jiān)果類果樹，其果仁富含多種營養(yǎng)成分，味美可口，是世界上最佳的食用干果之一，素有“干果皇后”的美譽(yù)[11]。中國于1910年引種澳洲堅(jiān)果，1979年開始進(jìn)行商業(yè)種植，2021年種植面積達(dá)32.68萬hm2，成為世界上發(fā)展最快、種植面積最大的國家[12，13]。隨著種植面積不斷擴(kuò)大，澳洲堅(jiān)果表現(xiàn)出大量落花落果的現(xiàn)象，特別是早期生理落果，大量未成熟果實(shí)通常于盛花后20～50 d脫落[14]，嚴(yán)重影響果實(shí)產(chǎn)量的增加。

目前，國內(nèi)有報(bào)道認(rèn)為果柄的能量代謝可能參與了澳洲堅(jiān)果響應(yīng)饑餓脅迫所引起的果實(shí)脫落誘導(dǎo)調(diào)控[15]，而有關(guān)澳洲堅(jiān)果果柄離區(qū)顯微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁相關(guān)酶與果實(shí)脫落關(guān)系的研究還未見報(bào)道。因此，本研究以澳洲堅(jiān)果正常果和脫落果果柄離區(qū)為樣品，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞壁相關(guān)酶（纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶）活性差異分析，為澳洲堅(jiān)果落果機(jī)理研究和生產(chǎn)上采取相應(yīng)措施防止果實(shí)脫落提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所廣西澳洲堅(jiān)果良種培育中心試驗(yàn)基地（N22°54'8''/E108°20'4''）。選擇樹齡8年、樹勢(shì)較一致、生長勢(shì)良好、無病蟲害的澳洲堅(jiān)果樹為試驗(yàn)材料，株行距5 m×6 m，樹體通風(fēng)透光、枝條分層合理，以常規(guī)管理方式進(jìn)行田間管理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以3株澳洲堅(jiān)果樹為1個(gè)重復(fù)單元，每個(gè)處理3次重復(fù)，分別在盛花后30 d、40 d、50 d采集正常果和脫落果果柄部位，一部分用于果柄離區(qū)的形態(tài)學(xué)觀察，一部分經(jīng)液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室存放于-80 ℃冰箱，用于細(xì)胞壁相關(guān)酶活性的測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 石蠟切片制作及顯微結(jié)構(gòu)觀察

切取果柄離區(qū)上下0.5 cm范圍的組織，用FAA（無水乙醇∶冰乙酸∶甲醛∶水= 50∶5∶40∶5，添加少量甘油）固定24 h以上，參照張俊超等[16]方法進(jìn)行切片制作及番紅—固綠染色，利用顯微鏡觀察離區(qū)的細(xì)胞組織形態(tài)，并采集分析具有典型結(jié)構(gòu)的圖像。

1.3.2 細(xì)胞壁相關(guān)酶活性的測(cè)定

纖維素酶活性的測(cè)定：稱取約0.1 g樣品，加入1 mL提取液（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH為4.8），用移液器將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，于4℃，12000 r·min-1離心10 min，取上清至冰上待測(cè)。試驗(yàn)對(duì)纖維素酶采用纖維素酶（CL）活性檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：BC2545，規(guī)格：100T/48S）進(jìn)行反應(yīng)并在酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

多聚半乳糖醛酸酶活性的測(cè)定：稱取約0.1 g樣品，加入1 mL提取液（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH為6.0），用移液器將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，于4℃ 12000r·min-1離心10 min，取上清至冰上待測(cè)。試驗(yàn)對(duì)多聚半乳糖醛酸酶采用多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：BC2660，規(guī)格：50T/24S）進(jìn)行反應(yīng)并用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 19.0對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果柄離區(qū)的形態(tài)學(xué)觀察

通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，正常果和脫落果果柄存在明顯差異：正常果果柄無離層區(qū)域（圖1，a），表皮細(xì)胞排列緊密（圖1，c）；而脫落果果柄具有明顯的離層區(qū)域（圖1，b），且離層由2～3層大體積、橢圓形的細(xì)胞松散排列組成，細(xì)胞間隙較大（圖1，d），說明了相鄰細(xì)胞間粘附力降低。從染色結(jié)果可見，離層細(xì)胞被番紅染為深紅色，而周圍組織細(xì)胞被染為淺紅色或未被染色，說明了離層細(xì)胞的木質(zhì)化程度高于周圍組織細(xì)胞。

2.2 果柄離區(qū)中纖維素酶活性的差異

纖維素酶是分解細(xì)胞壁纖維素基質(zhì)多糖的關(guān)鍵酶。由圖2可知，在澳洲堅(jiān)果早期生理落果期間，正常果果柄離區(qū)中纖維素酶活性呈“先升后降”的變化趨勢(shì)，脫落果前期趨勢(shì)相近，但在盛花40 d后雖稍有下降但依然保持較高水平，且顯著高于周期正常果；從整體上看，正常果果柄離區(qū)中纖維素酶活性極顯著低于脫落果，說明澳洲堅(jiān)果落果與纖維素酶的高活性相關(guān)，澳洲堅(jiān)果果實(shí)脫落過程中纖維素 酶在果柄離區(qū)可能參與了細(xì)胞壁的降解。

2.3 果柄離區(qū)中多聚半乳糖醛酸酶活性的差異

多聚半乳糖醛酸酶是植物器官脫落過程中的主要代謝酶類之一。由圖3可知，在澳洲堅(jiān)果早期生理落果期間，正常果離區(qū)多聚半乳糖醛酸酶活性呈“升高”趨勢(shì)，脫落果果柄離區(qū)多聚半乳糖醛酸酶活性呈“先升后降”的變化趨勢(shì)；正常果和脫落果果柄離區(qū)在多聚半乳糖醛酸酶活力值存在極顯著差異，說明了細(xì)胞壁可能被多聚半乳糖醛酸酶所降解。

3 討論

離區(qū)是植物器官脫落發(fā)生的特定部位，一般由5～50層體積小且排列緊密的細(xì)胞構(gòu)成，其中1～2層細(xì)胞分化為離層從而觸發(fā)脫落[17]。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同物種或不同器官的離層存在差異[18]，離區(qū)細(xì)胞與相鄰細(xì)胞在形態(tài)學(xué)有明顯的區(qū)別[19]。本研究對(duì)澳洲堅(jiān)果果柄進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，果柄離層細(xì)胞有2～3層，其木質(zhì)化程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于周圍組織細(xì)胞，推測(cè)離層木質(zhì)化程度是造成澳洲堅(jiān)果早期落果的重要因素之一。

果實(shí)脫落過程中僅有離區(qū)的形成不一定會(huì)使果實(shí)脫落，果實(shí)脫落啟動(dòng)需要感受到特定的脫落信號(hào)[20]，而離區(qū)細(xì)胞感受脫落信號(hào)導(dǎo)致果實(shí)脫落的過程主要是一些細(xì)胞壁水解酶在起作用，其中多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶等是果實(shí)脫落的主要功能酶類[21]。有研究指出，在植物器官脫落中，纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶在離區(qū)中的活性呈現(xiàn)高表達(dá)的水平[22]。本研究中，在澳洲堅(jiān)果早期生理落果期間，脫落果果柄中纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶的活性均顯著高于正常果，脫落果果柄離層細(xì)胞間隙變大，表明了在澳洲堅(jiān)果果實(shí)脫落中，細(xì)胞壁可能被纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶所降解，使得細(xì)胞與細(xì)胞之間粘附力下降，從而發(fā)生分離，進(jìn)而促進(jìn)果實(shí)的脫落，這與龍眼[23]、葡萄[24]研究的結(jié)果一致。

然而，果實(shí)脫落是一個(gè)多方面調(diào)控的復(fù)雜生理過程，如高ABA/IAA比值能夠增強(qiáng)離層細(xì)胞壁分解酶活性，促進(jìn)離層的形成[25]；生長素和赤霉素均能抑制離區(qū)纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶活性的升高，以減少或阻止幼果脫落[26]；乙烯促進(jìn)果實(shí)的脫落主要是活化了纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶兩種酶的活性[27]；外源噴施乙烯誘導(dǎo)果實(shí)脫落的過程中，離區(qū)多聚半乳糖醛酸酶活性顯著增加[4，21]。可見，脫落發(fā)生時(shí)細(xì)胞壁水解酶與內(nèi)源激素協(xié)調(diào)調(diào)控器官脫落過程有關(guān)，而本研究僅僅關(guān)注細(xì)胞壁相關(guān)酶對(duì)澳洲堅(jiān)果早期生理落果的響應(yīng)，未開展其與內(nèi)源激素等調(diào)節(jié)物質(zhì)之間的相互作用機(jī)理分析。因此，關(guān)于澳洲堅(jiān)果早期生理落果的調(diào)控機(jī)理和潛在分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：謝紅輝

基金項(xiàng)目：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（桂農(nóng)科2024YP131，2022YM11，2021YT155）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技先鋒隊(duì)“強(qiáng)農(nóng)富民”“六個(gè)一”專項(xiàng)行動(dòng)項(xiàng)目（桂農(nóng)科盟202304-07）；廣西科技基地和人才專項(xiàng)（桂科AD18281005）。

第一作者：李穆（1989—），女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹参锷砼c分子生物學(xué)，E-mail：1009129466@qq.com。

*通信作者：趙淵（1992—），女，碩士，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，E-mail：260650584@qq.com。

收稿日期：2023-08-11