胃腺癌進展及預后關鍵基因與免疫浸潤分析

陳德合，夏天紅，王 杰，郭 剛，杜成周，尚力凝，陳 鵬，李洪濤

腫瘤是全球重大公共衛生問題，嚴重威脅著人類生命健康，其中在全球有57個國家(包括中國)腫瘤超過心血管疾病成為導致死亡的第一殺手[1-2]。胃癌是人類消化道發病率和病死率最高的腫瘤，僅2020年全球新發胃癌患者108.9萬例，因胃癌死亡達76.9萬例[3]。胃腺癌是胃癌的主要類型，起源于胃最表層或黏膜腺體，約占胃癌90%，發病原因可能與環境和遺傳因素有關，但具體發病機制仍不清楚[4]。因此,尋找診斷、治療和預后判斷的新標志物對胃腺癌精準診療及預后改善尤為重要。隨著生物、醫學及科技領域的日新月異，蛋白質分子組學、高通量測序及生物信息學技術不斷應用，使得精準診療成為可能。大數據時代的到來，公共醫學數據庫不斷涌現，推動了醫學的快速發展，進而為腫瘤基礎醫學和轉化醫學研究者貢獻了大量基因組數據和其關聯臨床數據。本研究欲通過可視化的GEPIA 2.0腫瘤數據分析平臺，對TCGA及GTEx中胃腺癌及癌旁組織的差異基因及預后相關基因進行分析，以期發現胃腺癌新的診斷標志物或潛在的治療靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 利用GEPIA 2.0腫瘤數據分析平臺，對TCGA和GTEx數據庫中408個胃腺癌和211個癌旁組織樣本RNASeq的數據進行可視化基因表達動態分析；運用FunRich(Version 3.1.3)軟件進行GO和KEGG富集分析；接著通過GEPIA 2.0和StarBase v2進行關鍵基因表達與預后生存驗證，確定有意義的關鍵基因；進而利用TIMER 2.0和TISIDB數據庫探討關鍵基因表達與免疫細胞浸潤的相關性；最后構建預后風險模型進行Cox回歸分析。

1.2研究方法

1.2.1基因差異表達分析及驗證:在GEPIA 2.0平臺中選擇FUNCTIONS菜單下的Expression Analysis,然后選擇Differential Genes。篩選條件：①Dataset (Cancer name)選擇胃腺癌；②Differential Methods 選擇 ANOVA；③| Log2FC | Cutoff: 1，q-value Cut off: 0. 01；④Gene/Isoform 選擇 Gene；⑤Chromosomal Distribution 選擇 Both；⑥比對GRCh38. p2(NCBI),得到差異基因和其染色體分布圖。

1.2.2預后差異相關基因分析：在GEPIA 2.0平臺中選擇FUNCTIONS中的Expression Analysis,然后選擇Survival Analysis 再選擇Most Differential Survival Gens。篩選條件：①Datasets Selection 選擇胃腺癌；②Gene/Isoform 選擇Gene；③Methods 為 Overall Survival or Disease Free Survival；④Group Cutoff 為 Median；⑤得到預后總生存期(OS)和無病生存期(DFS)相關基因。

1.2.3韋恩圖和GO、KEGG富集分析：通過韋恩圖對胃腺癌差異基因與預后OS和DFS相關的基因做交集，得到交集基因后應用基因富集軟件FunRich(Version 3.1.3)完成差異相關基因的GO和KEGG富集分析。

1.2.4差異基因表達和預后生存驗證：通過GEPIA 2.0和StarBase v2對鑒定的差異基因進行表達和預后生存驗證，確定胃腺癌差異表達且與預后相關的關鍵基因。

1.2.5關鍵基因表達與免疫細胞浸潤水平、豐度相關性：通過TIMER 2.0和TISIDB數據庫分析關鍵基因表達與免疫細胞浸潤水平、豐度的相關性。

1.2.6單因素和多因素Cox回歸分析：從TCGA數據庫獲得胃腺癌的RNAseq數據(level3)和相應的臨床信息，進行單因素和多因素Cox回歸分析，并通過“Forestplot”包分析每個變量。

2 結果

2.1差異表達基因 應用GEPIA 2.0對TCGA和GTEx數據庫中408個胃腺癌和211個癌旁組織樣本RNASeq的數據進行差異基因篩選，獲得4644個差異表達基因，其中上調基因有3746個，下調基因有898個。上調前10位基因為CEACAM5、CEACAM6、RNU11、CLDN3、CST1、OLFM4、REG4、MUC3A、MUC13和CLDN4，見表1；下調前10位基因為PGA3、PGA4、PGA5、LIPF、GKN1、GIF、PGC、ATP4B、ATP4A和GKN2，見表2。差異表達基因主要染色體分布見圖1。

表1 胃腺癌差異表達基因表達上調前10位基因

表2 胃腺癌差異表達基因表達下調前10位基因

圖1 胃腺癌差異表達基因主要染色體分布

2.2差異表達且與預后生存相關基因 通過韋恩圖對胃腺癌差異基因與預后OS和DFS相關排序前500位基因分別做交集，通過統計得出GFRA3、APBB1、ABCA8、PLCXD3、FAM153B、CLRN3、CD300LG及ASF1B 8個差異表達基因與預后OS、DFS相關，見圖2a；差異表達基因名稱、編號及在胃腺癌與癌旁組織的表達情況及差異性詳見表3。進一步通過GEPIA 2.0進行差異相關基因對比分析，探索8個差異相關基因在31種腫瘤癌與癌旁組織表達的差異熱圖，見圖2b,通過對比熱圖發現不同腫瘤癌與癌旁組織差異相關基因表達不同，可能與腫瘤的組織特異性有關，為腫瘤的診斷和治療提供了新的思路。

圖2 胃腺癌差異表達基因與預后總生存期(OS)、無病生存期(DFS)相關基因韋恩圖及在不同腫瘤中表達差異熱圖

表3 胃腺癌差異表達且與預后生存相關8個基因

2.3差異相關基因GO和KEGG富集分析 通過基因富集軟件FunRich(Version 3.1.3)對8個差異相關基因進行GO分析發現這些基因主要富集的細胞組分 (cellular component， CC)13個，分子功能(molecular function， MF)6個，生物學過程(biological process， BP)7個；KEGG富集分析發現其涉及的通路有3條。CC中主要集中在細胞核(40.0%)、細胞膜(40.0%)、細胞質(40.0%)、膜內(40.0%)和膜外(20.0%) 等13個細胞組分。MF中主要涉及受體活性 (12.5%)、磷脂酶活性(12.5%)、輔助轉運蛋白活性(12.5%)、分子伴侶活性(12.5%)和未知功能(37.5%)等6個功能簇。BP中主要包含信號傳導(25.0%)、細胞通訊(25.0%)、新陳代謝(12.5%)、物質運輸(12.5%)和未知生物學過程(37.5%) 等7個生物過程。KEGG富集分析結果表明，差異相關基因主要參與ABC家族蛋白介導的轉運(50%)、核雌激素受體α網絡(50%)和小分子的跨膜轉運(50%)3條信號通路，見圖3a～3d。

圖3 胃腺癌差異相關基因GO及KEGG富集分析

2.4驗證差異相關基因表達與預后關系 利用GEPIA 2.0和StarBase v2.0基因表達數據和臨床信息，驗證篩選到的8個差異相關基因在胃腺癌與癌旁組織的表達及預后分析，最終確定ABCA8、PLCXD3、CLRN3、CD300LG及ASF1B 5個為關鍵基因。①通過驗證表明ABCA8、PLCXD3和CD300LG在胃腺癌組織低表達,CLRN3和ASF1B在胃腺癌組織高表達(P<0.01)，見圖4和圖5。②通過驗證表明在胃腺癌中ABCA8、PLCXD3和CD300LG低表達患者OS和DFS較長，CLRN3和ASF1B高表達患者OS和DFS較長(P<0.05)，見圖6和圖7。

2.5胃腺癌關鍵基因表達與免疫細胞浸潤相關性 通過腫瘤免疫在線研究工具TIMER 2.0和TISIDB數據庫探討5個關鍵基因表達與免疫細胞浸潤水平、豐度相關性，發現5個關鍵基因表達與免疫細胞浸潤水平、豐度具有相關性(r>0.3,P<0.01)，見圖8和9。

圖4 GEPIA 2.0驗證胃腺癌關鍵基因表達

圖5 StarBase v2.0驗證胃腺癌關鍵基因表達

圖6 GEPIA 2.0驗證胃腺癌關鍵基因表達與預后關系

圖7 StarBase v2.0驗證胃腺癌關鍵基因表達與預后關系

2.6關鍵基因預后風險模型Cox回歸分析 從TCGA數據庫獲得375個胃腺癌的RNAseq數據(level3)和相應的臨床信息,構建關鍵基因預后風險模型，進行單因素和多因素Cox回歸分析。單因素Cox回歸分析顯示5個關鍵基因(ABCA8、ASF1B、CD300LG、CLRN3、PLCXD3)、性別、pTNM分期及病理分級是胃腺癌預后的相關風險因素(P<0.05，P<0.01)；多因素Cox回歸分析顯示性別、pTNM分期和病理分級是胃腺癌預后的獨立風險因素(P<0.01),詳見表4。

3 討論

胃癌發病率男性是女性的2倍，在東亞和東歐發病率最高，其為發病率和病死率最高的三大癌癥之一[3]。胃腺癌是胃癌的主要類型，可能由飲食習慣、激素水平、慢性胃炎及幽門螺旋桿菌感染等多種因素引起，現其發病機制仍不清楚。雖然早期胃癌患者術后5年生存率為90%，但胃癌患者發現時多位于晚期[5]。近年來胃癌診治手段已經有了很大進展,但在我國胃癌的5年生存率僅為35.9%,遠低于日本的60.3%和韓國的68.9%[6]。隨著新的技術發展，尤其是分子生物學、基因芯片、生物信息技術及大數據等在醫療領域的應用,腫瘤的早期診斷和精準治療成為當前研究的熱點。胃腺癌的研究轉向分子水平的發病機制、驅動基因、診斷標志物及靶向治療的研究。因此,探討與胃腺癌診療相關的分子標志物，對其預后改善具有重要意義。

本研究通過可視化腫瘤數據分析平臺GEPIA 2.0進行差異基因和預后生存相關基因鑒定，并使用韋恩圖篩選與腫瘤發生、發展及預后相關的關鍵基因，通過不同數據庫驗證及免疫浸潤探討、預后風險模型預測，最終確定ABCA8、PLCXD3、CLRN3、CD300LG及ASF1B 5個基因為胃腺癌進展與預后的關鍵基因，其表達與免疫細胞浸潤具有相關性，且可作為預后風險模型的相關風險因素。

ABCA8位于人類第17條染色體長臂2區4帶2亞帶(17q24.2)，屬ABC轉運蛋白超家族成員，編碼的蛋白質可能調節脂質代謝并參與髓鞘的形成和維持，然而最近發現其在部分腫瘤中發揮重要的功能作用。有學者在肝細胞癌中發現ABCA8表達下調,其過表達后抑制肝細胞癌的生長和轉移，且低表達患者預后OS較長[7]，這與本研究結果相同。ZHANG等[8]也發現ABCA8在肝細胞癌中表達下調，而低表達患者生存時間顯著縮短。另有文獻報道ABCA8通過激活ERK信號通路不但促進人胰腺癌細胞的遷移和侵襲，而且還顯著降低了人胰腺癌細胞在體外和體內對吉西他濱的敏感性[9-10]，這與陳靜等[11]發現在骨肉瘤細胞中ABCA8參與耐藥的結果一致。近期有學者在對乳腺癌的研究中發現ABCA8可通過調控AMP活化蛋白激酶/哺乳動物西羅莫司靶點信號通路抑制乳腺癌細胞增殖[12]。我們通過生物信息分析發現ABCA8在胃腺癌中也異常表達，參與腫瘤的進展、預后，與CD4+、巨噬細胞、樹突狀細胞的免疫浸潤水平相關性較高。

圖8 TIMER 2.0數據庫探討關鍵基因表達與胃腺癌免疫細胞浸潤水平相關性

圖9 TISIDB數據庫探討關鍵基因表達與胃腺癌免疫細胞浸潤豐度相關性

表4 胃腺癌患者關鍵基因預后風險模型單因素和多因素Cox回歸分析

PLCXD3位于人類第5條染色體長臂1區3帶1亞帶(5q13.1)，屬磷酸肌醇特異性磷脂酶家族成員。此前，有研究發現胰腺β細胞中PLCXD3的低表達與關鍵胰島素信號傳導、胰島素生物合成基因下調及葡萄糖感應降低有關，并且與代謝綜合征風險相關[13-14]。近期有研究報道PLCXD3在尿路上皮癌中低表達[15]，與本研究顯示PLCXD3在胃腺癌中表達一致。此外，CHEN等[16]通過對胃腺癌轉錄組調控的綜合基因組和表觀基因組分析發現PLCXD3在侵襲性胃腺癌的發展中發揮了關鍵作用,免疫浸潤分析其表達與CD4+、CD8+、巨噬細胞和中性粒細胞的富集水平呈正相關。本研究發現PLCXD3表達與CD4+、巨噬細胞、肥大細胞、激活B細胞和嗜酸粒細胞的浸潤豐度相關性較高。

CLRN3位于人類第10條染色體長臂2區6帶2亞帶(10q26.2)，編碼一種細胞外泌體蛋白，主要富集在小腸、結腸、十二指腸、肝和腎等，現對其基因及蛋白研究甚少，其作用和功能尚不清楚。MALLANNA等[17]發現CLRN3在肝細胞分化的最后階段高度富集。然而，ZENG等[18]研究分析證實CLRN3可能是子宮內膜癌的特定甲基化驅動基因，參與其發生機制，并且與OS顯著相關。本研究首次發現CLRN3在胃腺癌中高表達，且高表達患者OS、DFS較長，與效應記憶CD8+、自然殺傷T細胞、1型T輔助細胞等免疫浸潤豐度呈負相關。

CD300LG位于人類第17條染色體長臂2區1帶3亞帶1次亞帶(17q21.31)，編碼一種包含單個免疫球蛋白V樣結構域的Ⅰ型細胞表面糖蛋白。ZHAI等[19]發現CD300LG在肺癌中表達下調，可能導致免疫細胞殺傷功能受到抑制，導致癌細胞免疫逃逸；而另有報道顯示CD300LG可提高細胞因子誘導殺傷的細胞毒活性[20]。此外，在乳腺癌[21]和急性髓系白血病[22]中也發現CD300LG表達下調。本研究首次發現CD300LG在胃腺癌中低表達，且低表達患者OS、DFS較長，與CD4+、巨噬細胞、樹突狀細胞、激活B細胞等免疫浸潤豐度相關性較高。

ASF1B位于人類第19條染色體長臂1區3帶1亞帶2次亞帶(19q13.12)，屬伴侶蛋白 H3/H4 家族的成員，編碼的蛋白為細胞周期調節激酶類凌亂樣激酶家族的底物，在調節染色質的核小體結構中發揮關鍵作用，其在腫瘤的表達與免疫浸潤成為近年來研究的熱點。OUYANG等[23]在肝細胞癌的研究中發現ASF1B高表達，高表達患者擁有低生存率，且與免疫細胞浸潤顯著相關。另外，在膠質瘤和胰腺癌中同樣發現ASF1B表達顯著升高，且是預后不良的因素[24-25]。本研究在胃腺癌患者中發現ASF1B高表達，且高表達患者預后較好，免疫浸潤分析顯示其表達與巨噬細胞、CD4+、B細胞等免疫浸潤呈負相關。

總之，本研究基于TCGA、GTEx、GEPIA 2.0、StarBase v2.0、TIMER 2.0、TISIDB數據庫及FunRich軟件，以及從TCGA數據庫獲得胃腺癌的RNAseq數據(level3)和相應的臨床信息，進行單因素和多因素Cox回歸分析，發現ABCA8、PLCXD3、CLRN3、CD300LG及ASF1B 5個基因在胃腺癌中異常表達，且與預后相關，并與免疫細胞浸潤具有相關性，可作為預后風險模型的相關風險因素，其中CLRN3和CD300LG是首次被報道在胃腺癌異常表達且參與腫瘤免疫細胞浸潤。