達格列凈對2型糖尿病合并慢性心力衰竭患者微小RNA-423-5p的調控作用及心功能的影響研究

陳瑞敏，劉放，談紅*，韓淑芳，陳英劍，蘇叢叢

心力衰竭（HF）是各種心血管疾病導致心室收縮和/或舒張功能障礙的一組臨床綜合征［1］。HF患者糖尿病患病率為10%～47%，住院HF患者糖尿病患病率達40%以上；糖尿病是HF的獨立危險因素，糖尿病患者中HF患病率為9%～22%，比普通人群高4倍，60歲及以上糖尿病患者HF患病率更高［2-3］。合并HF的2型糖尿病（T2DM）患者發生心腎臨床結局的風險增加［4-5］。西班牙的一項回顧性研究中發現T2DM合并HF患者的住院期間死亡風險和心腎臨床結局風險均顯著增加［6］。目前臨床上采用以“血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）/血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）/血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑（ARNI）、醛固酮受體拮抗劑、β-受體阻滯劑”為主的“金三角”藥物治療HF，但HF患者的再住院率、死亡率仍然很高。2019年DAPA-HF研究結果重磅發布，國內外指南相繼更新，達格列凈被正式列入HF標準治療，推動HF治療由“金三角”轉向“新四聯”，為HF的治療增加了新的選擇［7］。

達格列凈作為鈉-葡萄糖共轉運蛋白2抑制劑（SGLT2i）的代表藥物，已證實其具有獨立于降糖作用之外的心血管保護作用。《2021年歐洲心臟病學會急慢性心力衰竭診斷與治療指南》［7］已明確推薦將SGLT2i（達格列凈、恩格列凈）用于HF的治療。CURTAIN等［8］研究表明在射血分數減少的心力衰竭（HFrEF）患者的常規治療基礎上加用達格列凈可降低患者發生嚴重室性心律失常、心臟驟停和猝死的風險。LIN等［9］研究表明達格列凈能夠抑制心肌纖維化和內質網應激，改善血流動力學。王慧等［10］進行的關于SGLT2i治療HF療效及安全性的Meta分析表明，SGLT2i尤其是達格列凈可提高HFrEF患者的生存率，且安全性較好。上述證據均表明達格列凈具有較好的心血管保護作用，但其改善HF預后的作用機制尚未完全闡明。已有研究表明，微小RNA（miRNA）可以調控相關基因表達，在心肌細胞損傷、凋亡、心肌纖維化等方面發揮著重要作用［11-12］。既往研究表明慢性心力衰竭（CHF）患者血漿miRNA-423-5p表達水平升高，并且隨著心功能好轉，其表達水平降低［13］。但達格列凈是否通過調控miRNA-423-5p表達而發揮改善心功能的作用尚未見相關報道。故本研究納入T2DM合并CHF患者，觀察達格列凈對心功能的改善作用及其與miRNA-423-5p水平的相關性，進一步探索達格列凈改善HF預后的作用機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入2021-04-01至2021-11-30就診于解放軍第九六〇醫院的T2DM合并CHF患者50例為研究對象。納入標準：（1）年齡18～80歲；（2）CHF診斷符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018年》［14］標準，即HF病程≥3個月，紐約心臟病協會（NYHA）心功能分級Ⅱ～Ⅳ級，且左心室射血分數（LVEF）＜40%；（3）T2DM診斷符合《中國2型糖尿病防治指南（2020年）》［15］標準，存在典型的糖尿病癥狀，隨機血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖（FBG）≥7.0 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）2 h血糖≥11.1 mmol/L或糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%，且T2DM病程≥3個月；（4）入組前未服用過SGLT2i；（5）簽署知情同意書。排除標準：（1）急性失代償HF者；（2）1型糖尿病者；（3）嚴重心律失常、急性心肌梗死、瓣膜病、嚴重肺心病、肥厚型心肌病者；（4）低血壓、反復低血糖發作者；（5）嚴重肝、腎功能不全者；（6）嚴重感染性疾病、血液透析、惡性疾病患者；（7）妊娠期及哺乳期婦女。另納入同一時期于本院健康體檢的心功能正常者25例。納入標準：（1）患者18～80歲；（2）無心血管系統疾病。本研究經解放軍第九六〇醫院倫理委員會批準〔（2021）科研倫理審第（113）號〕，所有患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑及儀器 達格列凈片（阿斯利康，10 mg/片）；miRNA提取分離試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒及miRNA熒光定量檢測試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，聚合酶鏈式反應（PCR）特異上游引物由美國GeneCopoeia公司合成。微量分光光度計（NanoDrop 2000型）購自美國Therom Scientific公司，Light Cycle 480Ⅱ PCR擴增儀購自瑞士Roche公司。

1.2.2 分組 將符合納入標準的T2DM合并CHF患者分為達格列凈組（n=25）和對照組（n=25），達格列凈組給予達格列凈10 mg/d，對照組給予其他降糖藥物，余治療原則相同，治療6個月。健康體檢心功能正常者為健康人群組（n=25）。

1.2.3 資料收集 通過數字病歷系統收集患者的基本資料，包括年齡、性別、吸煙史（定義為連續或累計吸煙時長≥6個月，吸煙量≥1支/d）、高血壓史（定義為臨床診斷明確、服用或未服用降壓藥物）、血壓水平、體質指數（BMI）、血脂〔總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）〕、血糖（FBG、HbA1c）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、肌酐（Cr）、氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、NYHA心功能分級、心臟彩超〔LVEF、左心室舒張末期內徑（LVEDD）、每搏輸出量（SV）、左心室短軸縮短率（LVFS）〕、合并用藥情況。合并用藥包括利尿劑（呋塞米片、螺內酯片）、β-受體阻滯劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）抑制劑（ACEI，ARB）、硝酸酯類藥物、血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑、抗血小板藥物、曲美他嗪；并留取血液標本進行miRNA-423-5p的檢測。資料收集由兩位心內科醫師獨立完成，并進行交叉核對，確保信息的準確性及真實性。

1.2.4 隨訪 以納入患者入組后首次服用達格列凈的時間為隨訪起點，隨訪觀察6個月。治療4周時進行門診隨訪，收集患者心功能指標及miRNA-423-5p的結果。治療6個月時進行門診隨訪，收集患者心功能指標、血壓水平、ALT、AST、Cr。

1.2.5 血漿樣本的收集、分離及儲存 分別于患者入院后第2天清晨和健康體檢者體檢時采集空腹肘靜脈血4 ml，置于抗凝管中，于4 ℃條件下3 000 rpm離心10 min（離心半徑15 cm），收集上清液。將上清液等量分裝后保存于-80 ℃冰箱中備用。T2DM合并CHF患者于治療4周后再次采集肘靜脈血4 ml，如前方法處理。

1.2.6 血漿總RNA的提取 將凍存的血漿樣本在室溫下解凍，4 ℃條件下15 000 rpm/min離心5 min，轉移200 μl上清液至新的RNase-Free EP管中。按照試劑盒說明書進行總RNA的提取，以RNase-Free水作為空白對照進行調零，1.9＜OD260/OD280＜2.1說明RNA純度良好。選取質量好的標本進行反轉錄。

1.2.7 檢測血漿miRNA-423-5p水平 血漿miRNA-423-5p水平檢測采用反轉錄及熒光定量PCR法。按照試劑盒說明書進行3'末端加多聚A尾及反轉錄。將得到的反轉錄反應液作為模板，以U6作為內參，進行定量PCR反應。miRNA-423-5p的相對表達水平采用2-ΔΔCt方法計算。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用配對t檢驗比較組內干預前后的指標變化；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗，采用配對秩和檢驗比較組內干預前后的指標變化；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關分析或Spearman秩相關分析探究miRNA-423-5p表達水平與患者心功能指標的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 3組研究對象年齡、性別、吸煙史、高血壓、收縮壓、舒張壓、BMI、TC、LDL-C、HDL-C、TG、Cr比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；達格列凈組與對照組患者NYHA心功能分級、利尿劑使用情況、其他藥物使用情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 3組間一般資料的比較Table 1 Comparison of general data between three groups

2.2 對照組與達格列凈組干預4周、干預6個月心功能指標的比較 干預6個月達格列凈組患者LVEF、SV、LVFS高于對照組，LVEDD低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組干預4周、干預6個月LVEDD較同組干預前降低，LVEF、SV、LVFS較同組干預前升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 對照組與達格列凈組干預前后心功能指標的比較Table 2 Comparison of cardiac function indices between control group and agliazine group before and after intervention

2.3 干預4周NT-proBNP與miRNA-423-5p水平比較干預4周達格列凈組NT-proBNP、miRNA-423-5p水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組干預后NT-proBNP、miRNA-423-5p水平較同組干預前降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 對照組與達格列凈組干預4周NT-proBNP、miRNA-423-5p水平的比較Table 3 Comparison of NT-proBNP and miRNA-423-5p levels between control group and dapagliflozin group after four weeks of intervention

2.4 干預4周miRNA-423-5p表達水平與NT-proBNP水平、LVEF的相關性分析 相關性分析結果顯示，血漿miRNA-423-5p表達水平與NT-proBNP水平呈正相關（rs=0.609，P＜0.05），與LVEF呈負相關（r=-0.406，P＜0.05）。

2.5 達格列凈組干預前與干預6個月血壓及肝腎功能指標的比較 達格列凈組患者干預后收縮壓、舒張壓較干預前降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預后ALT、AST、Cr與干預前比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 達格列凈組干預前與干預6個月后血壓及肝腎功能指標比較Table 4 Levels of blood pressure，and liver and kidney function indices in dagagliflozin group before treatment and after six months of treatment

3 討論

HF的發病機制十分復雜，發病早期交感神經興奮性增強，RAAS激活發揮代償作用以維持正常的心臟輸出，但隨著病情進展逐漸出現心肌細胞損傷、心肌纖維化、心室重構等不可逆轉的心臟結構變化［1］。隨著社會進步發展，糖尿病患者數量不斷增加，臨床上糖尿病與HF多合并發生，二者相互促進并彼此增加疾病的發生風險［2-3］。2019年DAPA-HF研究重磅發布，國內外指南相繼更新，達格列凈被正式列入HF標準治療［7］。

DAPA-HF研究入選伴或不伴T2DM的HFrEF患者4 744例，以HF加重或心血管死亡作為主要終點事件，經過18.2個月的隨訪觀察發現達格列凈可減少26%的HF患者死亡等不良事件風險［16］。相關研究表明，達格列凈具有利尿、降糖降壓、促進酮體生成、增加血紅蛋白水平等作用，但其改善HF預后的具體機制尚不明確［17］。劉海浪等［18］研究發現達格列凈可以明顯下調HF大鼠心臟miRNA-671的表達水平，改善心功能。達格列凈通過影響miRNA的表達來發揮其改善心功能的作用有待進一步研究。

miRNA是一類長20～24個核苷酸的非編碼RNA，在人體生長、發育的各個階段均發揮著重要作用。miRNA不僅可在疾病的某些特定階段特異性表達，還可通過調控基因表達，在心肌細胞損傷、凋亡、纖維化及血管生成等病理進程中發揮重要作用［11-12］。近年國外研究表明，miRNA-423-5p在HF患者中的表達水平升高，并且隨著HF的發展而出現變化，與LVEF及NT-proBNP水平有一定的相關性［19-21］。既往研究表明，HF患者血漿miRNA-423-5p表達水平上調，并且其診斷CHF具有良好的特異度和靈敏度［22］。但達格列凈對miRNA-423-5p表達的調控作用及其與心功能改善的關系目前尚未見報道。

本研究納入T2DM合并CHF患者，研究達格列凈對其血漿miRNA-423-5p表達的影響及與心功能之間的相關性，進一步明確達格列凈改善心功能的作用機制。本研究中達格列凈組與對照組患者基線一般資料匹配，排除相關臨床干預因素對研究結果的影響。治療前達格列凈組與對照組患者心功能及血漿miRNA-423-5p的表達水平無明顯差異，排除基線水平差異可能對結果產生的影響。T2DM合并CHF患者在常規治療藥物基礎上加用達格列凈治療4周后，對照組與達格列凈組NT-proBNP及血漿miRNA-423-5p的表達水平均明顯下降，同時與對照組相比，達格列凈組NT-proBNP及血漿miRNA-423-5p的表達水平下降更為明顯，且血漿miRNA-423-5p表達水平與NT-proBNP水平呈正相關。治療4周后，達格列凈組及對照組患者左心室收縮功能改善，且血漿miRNA-423-5p表達水平與LVEF呈負相關。治療6個月后，與對照組相比，達格列凈組左心室收縮功能改善更為顯著。本研究結果明確了血漿miRNA-423-5p的表達水平對HF診斷的意義，并證明達格列凈可改善T2DM合并CHF患者的心功能，其作用機制可能與調控血漿miRNA-423-5p表達水平有關，為達格列凈改善心功能、治療HF的機制研究提供了新的方向。

本研究存在以下局限性：本研究觀察病例數較少，有待繼續擴大病例數量增強研究結果的可靠性。周詠梅等［23］的研究表明磷脂酰肌醇3-激酶通路可能在miRNA-423-5p參與的HF發生、發展進程中發揮著關鍵性作用，下一步可針對此信號通路行進一步機制研究。未來的研究可繼續擴大研究病例數量并針對miRNA-423-5p的下游靶標和其他相關miRNA進行臨床試驗及基礎研究，在分子水平上明確達格列凈改善HF患者預后的作用機制，以期有助于HF的診斷及治療。

綜上所述，達格列凈可改善T2DM并發CHF患者的心功能，降低NT-proBNP及LVEDD，提高LVEF、SV、LVFS，其作用機制可能與調控血漿miRNA-423-5p表達水平有關。

作者貢獻：陳瑞敏、談紅負責文章的構思、研究的設計及可行性分析；劉放、陳英劍負責研究的實施；劉放、韓淑芳、蘇叢叢負責數據收集、整理及統計學分析；陳瑞敏負責結果的分析與解釋、論文撰寫；談紅負責論文修訂、文章的質量控制及審校，監督管理，對文章整體負責。

本文無利益沖突。