FDCSP通過腫瘤微環境影響晚期肺鱗癌患者預后的研究

高紅葉 陳永霞 張瑋潔 崔宏偉

1.內蒙古醫科大學附屬人民醫院腫瘤分子診斷實驗室，內蒙古呼和浩特 010000；2.內蒙古醫科大學附屬人民醫院科研部，內蒙古呼和浩特 010000

2020年CA-CANCER J CLIN指出，肺癌的估計發病率和病死率在所有癌癥中位居首位[1]。肺癌主要分為小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC），分別約占13%和87%。肺鱗癌（LUSC）約占NSCLC的40%[2]。與肺腺癌相比，晚期LUSC臨床預后差，缺乏靶向藥物[3-5]。因此，全面地了解LUSC進展的分子機制對于開發新的治療方法至關重要。

近年來，研究證明[6-7]腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）在腫瘤進展和治療中起著重要作用。闡明TME在晚期LUSC中的生物學特性仍是一個挑戰。既往文獻[8]表明FDCSP能夠影響腫瘤進展，但是否與肺癌相關，尚不清楚。本研究通過生物信息學方法探討FDCSP在晚期LUSC中的作用，分析其作用機制，為探索晚期LUSC新的治療靶點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 數據來源及觀察指標

從TCGA數 據 庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載LUSC數據，下載時間為2022年4月。根據肺癌第8版TNM分期對患者重新分期，選取晚期（Ⅲ期及Ⅳ期）患者分析，流程如圖1。主要分析FDCSP表達與臨床特征（性別、年齡、種族、T分期、N分期、M分期、第8版TNM分期、位置、化療、化療效果）相關性。分析FDCSP對于總生存期（overall survival，OS）及無病生存期（disease free survival，DFS）的影響。探討FDCSP可能影響的生物學過程，免疫細胞浸潤的相關性以及突變情況和與腫瘤異質性關系。

1.2 方法

使用R3.6.1對數據進行下載。使用在線分析平臺Sangerbox（http://vip.sangerbox.com/）進行生存分析Kaplan-Meier曲線、Log-rank檢驗及腫瘤異質性分析。使用SPSS 26.0統計學軟件對臨床特征與FDCSP表達關系進行分析，對計數資料的比較采用χ2檢驗，對計量數據的比較采用t檢驗，相關性分析采用Pearson相關檢驗。使用R3.6.1中GSEA包進行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），使用ESTIMATES包進行ESTIMATES分析，突變采用maftools包進行分析。使用CIBERSORT算法進行免疫細胞浸潤分析。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FDCSP對于晚期LUSC患者預后影響。

下載TCGA中LUSC RNA-seq和臨床數據，按照第8版TNM分期整理，篩出晚期LUSC（Ⅲ和Ⅳ期）106例（圖1）。整理后刪除無生存期、無生存狀態等的患者。最終分別對103例和98例患者進行OS和DFS分析（圖2A～B），取最佳截止值。結果顯示，FDCSP表達對于晚期鱗癌患者OS（P＜ 0.001，HR=0.42）和DFS（P＜ 0.001，HR=0.41）均具有顯著影響。

圖1 分析流程

圖2 對不同表達量FDCSP的晚期LUSC患者進行OS（A）和DFS（B）分析

2.2 臨床特征關系

對進行OS分析的103例患者FDCSP表達情況與臨床特征進行分析（表1）。按照生存分析中OS最佳截止值，即兩組最佳截止中位值OS分別為14.73個月和44.75個月，對FDCSP進行分組。FDCSP的表達與臨床特征并無顯著關系

2.3 GSEA富集分析

GSEA發現（圖3A～C），高表達組主要影響免疫相關通路，而低表達組主要集中在代謝相關通路。為了進一步明確FDCSP的作用機制，對FDCSP于免疫方面相關影響進行了分析。

圖3 GSEA結果

表1 FDCSP與臨床特征關系

2.4 與免疫細胞浸潤相關分析

對103例患者進行ESTIMATES分析，發現ESTIMATEScore（t=-2.829，P＜ 0.01）、ImmuneScore（t=-3.802，P＜ 0.001）在不同FDCSP表達組有顯著差異，而StromalScore（t=-1.457，P=0.418）未見明顯差異（圖4A）。提示FDCSP可能與腫瘤免疫反應相關。因此，應用CIBERSORT分析晚期LUSC患者免疫細胞浸潤情況（圖4B），并與FDCSP的表達進行相關性分析（圖4C），發現FDCSP與巨噬細胞M2（P＜ 0.001）、調節T細胞（Tregs）（P＜ 0.001）浸潤顯著相關，與巨噬細胞M0（P=0.09）、靜止記憶CD4T細胞（P=0.070）具有相關趨勢。分析浸潤免疫細胞對于預后影響（幼稚CD4T細胞、T細胞γδ、嗜酸性粒細胞浸潤比例過低，無法進行生存分析）發現巨噬細胞M1（P=0.005）、靜止肥大細胞（P=0.010）、記憶B細胞（P=0.030）、活化記憶T細胞（P=0.020）顯著影響患者預后，并且活化樹突狀細胞（P=0.060）、靜止NK細胞（P=0.070）、靜息的記憶CD4T細胞（P=0.070）、巨噬細胞M2（P=0.090）具有影響預后趨勢。

圖4 FDCSP與免疫浸潤細胞關系

2.5 與突變關系

對多種腫瘤中FDCSP的突變情況分析發現其突變頻率很低，如膠質瘤（GBMLGG）、腦低級別膠質瘤（LGG）、結腸癌（COAD）、結直腸癌（COADREAD）、急性髓細胞樣白血病（LAML）、浸潤性乳腺癌（BRCA）、胃和食管癌（STES）、胃癌（STAD）、子宮內膜癌（UCEC）、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、LUSC、胰腺癌（PAAD）、膀胱尿路上皮癌（BLCA），可說明FDCSP基因的保守性。但在不同FDCSP表達組中發現，低表達組突變頻率更高，這可能與其更差的預后相關（圖5）。

圖5 FDCSP與突變關系

2.6 FDCSP對晚期肺鱗癌異質性的影響

為了進一步分析FDCSP對于晚期LUSC異質性的影響，對目前評估腫瘤異質性（tumour heterogeneity）的指標[9-12][腫瘤突變負荷（t=-1.283，P=0.203）；腫瘤特異性突變位點的MAF mutant-allele fractions值的分布偏差（t=-1.060，P=0.292）；微衛星不穩定性（t=-1.503，P=0.136）；腫 瘤 新 抗 原（t=-0.573，P=0.568）；腫瘤純度（t=-2.272，P=0.025）；同源重組缺陷評分（t=0.442，P=0.695）；基因組雜合缺失（t=-0.573，P=0.593）]進行分析（圖6），結果提示FDCSP表達顯著影響晚期LUSC腫瘤純度。

圖6 FDCSP對于晚期LUSC患者異質性影響

3 討論

LUSC約占NSCLC的40%[2]。晚期LUSC預后差，缺乏靶向藥物。因此，了解LUSC進展的分子機制對于開發新的治療方法至關重要。

FDCSP主要由B細胞激活FDC表達[13]，可以調節B細胞免疫反應[13-14]，并且可能在自身免疫性疾病中起作用[15]。FDCSP可通過促進癌細胞遷移和侵襲來促進卵巢癌轉移[8]，但是否與肺癌相關尚不清楚。

TME在疾病發生中起重要作用[6-7]。TME是指局部腫瘤細胞生長的環境，又稱腫瘤間質。TME不僅在腫瘤的發展過程中起關鍵作用，而且顯著影響治療效果[16-18]。TME，尤其是免疫組分，對腫瘤的發展起著重要作用。有研究已證實，將TME從腫瘤促進型轉變為腫瘤抑制型能夠顯著改善腫瘤治療效果[19]。

本研究發現FDCSP與預后顯著相關。同時，高表達FDCSP在免疫相關過程富集。巨噬細胞M2、調節T細胞與FDCSP表達密切相關。以上結果提示FDCSP可能通過調控TME中免疫細胞浸潤發揮作用。另外FDCSP是一種高度保守基因，其在大部分腫瘤中突變頻率均很低。腫瘤異質性是惡性腫瘤的重要特征，其在進展和耐藥性方面發揮重要作用[20]。本研究發現FDCSP低表達組基因整體突變頻率明顯增高，且FDCSP顯著影響晚期LUSC腫瘤純度。

綜上所述，本研究利用生物信息學分析發現FDCSP表達與晚期LUSC患者預后呈正相關，其作用機制可能與TME中免疫細胞的浸潤相關，FDCSP可以作為一個預后預測指標。以上均為生物信息學分析結果，進一步研究應側重于通過基礎實驗驗證分析其準確性。