石見穿配方顆粒的特征圖譜和含量測定

陳日榮 歐陽麗敏 楊佩雯 吳 弢

上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203

石見穿為唇形科植物華鼠尾草Salvia chinensisBenth.的干燥地上部分，始載于《本草綱目》，“主骨痛，大風(fēng)，癰腫”[1]。石見穿曾收錄于《中華人民共和國藥典》（1977年版），具有清熱解毒、活血利氣、止痛的功效，用于脘脅脹痛、癰腫等，此后歷版《中華人民共和國藥典》均未收錄。現(xiàn)代藥理研究表明，石見穿具有調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞[2-3]和抗肝癌[4-5]等作用，臨床上多應(yīng)用于婦科疾病、癌癥以及肝炎等的治療。其化學(xué)成分研究表明，石見穿含有迷迭香酸、熊果酸、齊墩果酸等化合物[6-7]。在質(zhì)量控制研究方面，文獻(xiàn)報(bào)道有采用薄層光密度法測定其齊墩果酸的含量[8]，或用HPLC測定齊墩果酸和熊果酸的含量[9]，也有以迷迭香酸為指標(biāo)建立石見穿藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。大量研究表明迷迭香酸具有抗炎[12-13]、神經(jīng)性保護(hù)[14]和抗神經(jīng)痛等作用[15]，由此推測迷迭香酸的藥理作用與石見穿清熱解毒和活血止痛功效相關(guān)。中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)提取濃縮制成的、供中醫(yī)臨床配方用的顆粒[16]。本研究以迷迭香酸為指標(biāo)，對(duì)石見穿配方顆粒進(jìn)行含量測定及其特征圖譜進(jìn)行研究，為石見穿配方顆粒的質(zhì)量控制和臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AE200S型萬分之一電子分析天平（上海梅特勒一托利多儀器有限公司）；BT25S型十萬分之一電子分析天平（北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KH-500E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

丹參素（批號(hào)：wkq18061906）、原兒茶醛（批號(hào)：TO1013FB14）、咖啡酸（批號(hào)：B21243）、迷迭香酸（批號(hào)：Y16A9K6740），均購于上海源葉生物科技有限公司，含量均≥98%；石見穿配方顆粒由某醫(yī)藥公司送樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

OSAKA SODA CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.0 μm）；柱溫25℃；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液。梯度洗脫：0～10 min，5→20%A；10～22 min，20→23%A。進(jìn)樣量5 μl；流速1.0 ml/min；特征圖譜檢測波長：240 nm；含量測定檢測波長：330 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取迷迭香酸、丹參素、原兒茶醛及咖啡酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加入甲醇制成1 mg/ml的迷迭香酸對(duì)照品溶液，和含丹參素0.20 mg/ml，原兒茶醛、咖啡酸及迷迭香酸均為0.05 mg/ml的參照物混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取石見穿配方顆粒0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入35%乙醇25 ml，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，用35%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 石見穿配方顆粒特征峰的標(biāo)定

吸取混合溶液與供試品溶液各5 μl，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖1。根據(jù)對(duì)照供試品和參照物色譜圖的保留時(shí)間，可以確認(rèn)峰1（5.926 min）、峰3（8.937 min）、峰4（10.927 min）、峰5（19.335 min）分別為丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和迷迭香酸。

圖1 石見穿配方顆粒的HPLC特征圖譜（240 nm）

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)制備陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明輔料對(duì)特征圖譜無影響，方法專屬性良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取石見穿配方顆粒S1，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，RSD均小于1.83%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取石見穿配方顆粒S1，按“2.3”項(xiàng)制備6份樣品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，RSD均小于1.69%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別于0、4、8、12、24、36、48和72 h連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，RSD均小于1.61%，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.6 石見穿配方顆粒特征圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定13批石見穿配方顆粒，將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》，采用全譜峰匹配，建立對(duì)照特征圖譜R，見圖2。計(jì)算相似度，10批石見穿配方顆粒S1～S10色譜圖與對(duì)照圖譜R的相似度均在0.90以上，表明其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量均一性較好；而不同廠家的石見穿配方顆粒樣品G1～G3的特征圖譜與對(duì)照圖譜R的相似度均在0.90以下，表明不同廠家生產(chǎn)的該配方顆粒在特征成分的種類和含量有明顯的區(qū)別。

圖2 13批石見穿配方顆粒的HPLC疊加特征圖譜

2.7 迷迭香酸的含量測定

分別精密吸取迷迭香酸對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，其色譜圖見圖3。結(jié)果顯示，樣品溶液中的峰1即為迷迭香酸。

圖3 迷迭香酸對(duì)照品（A）和石見穿配方顆粒樣品S1（B）的HPLC色譜圖（330 nm）

2.8 迷迭香酸含量測定方法學(xué)考察

2.8.1 線性關(guān)系考察 取迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，加入35%乙醇，搖勻，配制成迷迭香酸1 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。吸取不同體積的對(duì)照品儲(chǔ)備液，用35%乙醇稀釋制成不同濃度的系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品的濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，建立回歸方程：y=15539x+1.3366，r2=0.9998，線性范圍為0.0035～0.0420 mg/ml。

2.8.2 精密度試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定迷迭香酸的峰面積，RSD為0.51%，表明儀器精密度良好。

2.8.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取石見穿配方顆粒樣品S1，按“2.3”項(xiàng)平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果表明RSD為0.71%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別于0、4、8、12、24、36、48和72 h分別進(jìn)樣3次，結(jié)果表明RSD為0.89%，供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的石見穿配方顆粒樣品S1 0.25 g，共9份，其中每三份分別按照已知含量的50%、100%、150%加入對(duì)應(yīng)迷迭香酸（0.992 mg/ml）對(duì)照品溶液，平行制備9份樣品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，測定其峰面積，計(jì)算回收率（表1），結(jié)果表明平均加樣回收率為100.87%，RSD為0.58%。

表1 迷迭香酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.9 13批石見穿配方顆粒的含量測定

按照上面所建立的HPLC方法，對(duì)13批石見穿配方顆粒中迷迭香酸的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表2。其中10批石見穿配方顆粒樣品S1～S10中迷迭香酸的含量范圍為0.67～0.81 mg/g，均值為0.77 mg/g，按照含量均數(shù)±30%計(jì)算其含量波動(dòng)范圍。因此，擬定每1克石見穿配方顆粒中迷迭香酸的含量范圍為0.54～1.00 mg。而三批不同廠家的樣品G1～G3中迷迭香酸的含量差異較大，這與前面特征圖譜相似度研究的結(jié)果一致，其范圍為0.33～2.46 mg/g。

表2 石見穿配方顆粒中迷迭香酸的含量測定結(jié)果（n=3，mg/g，±s）

表2 石見穿配方顆粒中迷迭香酸的含量測定結(jié)果（n=3，mg/g，±s）

編號(hào) 迷迭香酸含量 編號(hào) 迷迭香酸含量S1 0.81±0.01 S8 0.78±0.01 S2 0.67±0.01 S9 0.77±0.02 S3 0.81±0.02 S10 0.78±0.01 S4 0.79±0.01 G1 1.80±0.01 S5 0.78±0.02 G2 0.33±0.03 S6 0.73±0.03 G3 2.46±0.03 S7 0.78±0.01

3 討論

在制備供試品溶液時(shí)，對(duì)提取溶劑和提取時(shí)間進(jìn)行了考察，比較了不同體積甲醇和乙醇及不同超聲時(shí)間對(duì)特征圖譜的影響，結(jié)果表明以35%乙醇超聲30 min提取的樣品，峰容量較大，各峰對(duì)稱性較好，分離度較合適。

在建立特征圖譜時(shí)，首先根據(jù)流動(dòng)相的組成進(jìn)行了優(yōu)化。石見穿的主要成分為迷迭香酸、丹參素、原兒茶醛等[17]，因此嘗試流動(dòng)相組成中含有0.1%三氟乙酸、0.1%甲酸溶液、0.1%醋酸水等改善峰對(duì)稱性[18-21]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用乙腈-0.1%甲酸溶液的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，分離效果好，且峰分布均勻。

由于迷迭香酸的藥理作用與石見穿清熱解毒和活血止痛功效相關(guān)，故選其作為含量測定的指標(biāo)。迷迭香酸的檢測波長[22-23]有320、325 nm等，本研究比較280、320、330、360 nm多個(gè)波長，結(jié)合峰形和分離度結(jié)果，選擇330 nm為含量測定的最終檢測波長。

丹參素的最大吸收波長為280 nm，300 nm之后無紫外吸收。當(dāng)檢測波長為330 nm時(shí)，丹參素?zé)o法檢測；保留時(shí)間9.351 min（最大吸收波長為326 nm）的峰干擾峰3原兒茶醛（Rt=9.104 min）。當(dāng)檢測波長為240 nm時(shí)，雜質(zhì)峰在240 nm只有微弱的紫外吸收，峰3原兒茶醛（最大吸收波長為230 nm）有較好吸收，干擾峰的吸收減弱；丹參素（峰1）能夠被檢測；同時(shí)特征圖譜的五個(gè)峰分離效果好，且峰分布均勻，故選擇240 nm為特征圖譜的最終檢測波長。

本研究建立了含丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸的特征圖譜，揭示石見穿更多的共有峰成分，為進(jìn)一步研究石見穿的成分提供了科學(xué)依據(jù)。由于經(jīng)過提取濃縮等工藝，配方顆粒已無原有藥材飲片的性狀特征，加上中藥產(chǎn)地和生產(chǎn)工藝等原因，使得中藥配方顆粒的質(zhì)量控制成為難點(diǎn)。所以質(zhì)控指標(biāo)仍選擇迷迭香酸，多個(gè)成分的含量測定需要進(jìn)一步的研究。