負載生長因子水凝膠的體外生物活性研究

鄧明　夏冠赫　劉鋒　李佳樂　王秉

摘 要： 為了開發一種新型生物活性傷口敷料，以絲素蛋白（SF）和酪胺改性明膠（TG）為基體材料，通過辣根過氧化物酶和過氧化氫催化交聯制備三維網狀水凝膠，并用水凝膠負載堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），制備SF-TG-bFGF水凝膠。對SF-TG-bFGF進行結構分析和形貌表征，檢測SF-TG-bFGF對小鼠成纖維細胞L929增殖、遷移和膠原蛋白合成的影響。結果表明：SF-TG-bFGF水凝膠具有良好的力學性能、吸濕保濕性能和生長因子緩釋性能；SF-TG-bFGF呈網狀微觀結構，彈性模量為21 kPa，溶脹率高達700%，能在144 h內緩釋bFGF；SF-TG-bFGF能促進L929細胞的增殖、遷移和膠原蛋白合成，細胞存活率可達300%，細胞遷移率可達90%，膠原蛋白質量濃度可達4.5 μg/mL。該研究制備的SF-TG-bFGF有望作為一種生物活性敷料應用于各類皮膚傷口治療。

關鍵詞： 生長因子；絲素蛋白；明膠；水凝膠；促膠原蛋白合成

中圖分類號： TB 34

文獻標志碼： A

文章編號： 1673-3851 （2023） 09-0581-08

引文格式：鄧明，夏冠赫，劉鋒，等. 負載生長因子水凝膠的體外生物活性研究［J］. 浙江理工大學學報（自然科學），2023，49（5）：581-588.

Reference Format： DENG Ming， XIA Guanhe， LIU Feng， et al. Study on the in vitro bioactivity of hydrogels loaded with growth factors［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（5）：581-588.

Study on the in vitro bioactivity of hydrogels loaded with growth factors

DENG Ming， XIA Guanhe， LIU Feng， LI Jiale， WANG Bing

（School of Materials Science & Engineering， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract： ?To develop a new bioactive wound dressing， a horseradish peroxidase and hydrogen peroxide cross-linking system was used to catalyze the formation of a three-dimensional reticular hydrogel of silk fibroin （SF） and tyramine-modified gelatin （TG）. This hydrogel was loaded with basic fibroblast growth factors （bFGF） and the SF-TG-bFGF hydrogel was formed. The SF-TG-bFGF hydrogel was structurally analyzed and morphologically characterized， and the effect of the SF-TG-bFGF hydrogel on the cell proliferation， migration capacity and collagen synthesis of mouse fibroblasts （L929） was examined. The results show that the SF-TG-bFGF hydrogel exhibits good mechanical properties， moisture absorption and moisture retention properties， and slow release performance of growth factors; SF-TG-bFGF has the network microstructure， the elastic modulus reaches 21 kPa， the swelling rate is as high as 700%， and bFGF is slowly released within 144 h; SF-TG-bFGF can promote the proliferation， migration and collagen synthesis of L929， with the cell survival rate， cell migration rate and mass concentration of collagen reaching 300%， 90% and 4.5 μg/mL， respectively. To sum up， the SF-TG-bFGF hydrogel prepared in this study is expected to be used as a bioactive dressing in the treatment of various skin wounds.

Key words： growth factor; silk fibroin; gelatin; hydrogel; promoting collagen synthesis

0 引 言

皮膚包覆于人體表面并長期暴露在外界環境中，由于日常活動和自身脆弱性［1］，經常受到創傷、燒傷和手術過程損傷［2］，破壞了皮膚的正常結構皮膚的正常結構遭到破壞，形成傷口。傷口的愈合是通過分子和細胞的協調作用恢復受損組織［3］。在愈合過程中，可能會發生皮膚組織的持續受損和皮膚病的不良誘導等現象，導致傷口愈合變慢。因此，加速高密度局部組織的形成和膠原沉積，促進再上皮化完成，是皮膚傷口快速愈合的重要途徑［4］。

近年來，生物活性敷料被廣泛應用于皮膚傷口愈合［5-6］，其中水凝膠敷料備受關注［7］。水凝膠是一種具有親水性的三維網狀材料［8］，可快速吸收大量水分并在溶脹后保持完整結構。水凝膠具有與天然組織彈性相似、吸收滲液并保證傷口濕愈合、充當屏障防止外物感染［9］和加速再上皮化［10］等特性，是最有前景的傷口愈合應用材料之一［11］。

目前，水凝膠已應用于傷口愈合領域，如可注射水凝膠能夠填充并黏附于各種不規則傷口部位［12］，負載活性物質的水凝膠［13］有利于加速全層皮膚缺損傷口愈合，水凝膠成功披覆紗線表面用于構建生物活性敷料支架［14］等。但水凝膠力學性能較差［15］限制了其在傷口愈合領域的廣泛應用。常規水凝膠只能提供濕愈合環境和基本的三維網狀結構，無法提供促細胞增殖、抗炎和促血管生成等生物活性。為了擴大水凝膠在傷口愈合領域的應用，科研人員開發了具有優異力學性能的生物活性水凝膠，以滿足其作為理想傷口敷料的要求［16］。負載生長因子的生物活性水凝膠避免了生長因子直接使用而失活，延長了生長因子的半衰期，對傷口愈合起到了顯著的促進作用［17］。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）可以促進成纖維細胞的增殖和膠原蛋白合成，從而加速傷口愈合，但bFGF的半衰期非常短，約1.5 min，且隨著傷口部位bFGF的快速擴散和傷口滲出液對bFGF的分解，bFGF的活性也會從給藥部位迅速喪失。因此，將bFGF負載到水凝膠等生物材料中，是提高bFGF生物利用率的有效途徑。桑蠶繭中絲素蛋白（SF）和動物身上提取的明膠（Gel）具有優異的生物相容性，通過對兩種物質的改性和復合可以制備水凝膠。如He等［18］制備了絲素蛋白水凝膠，可以有效釋放人酸性成纖維細胞生長因子，加速傷口愈合，但該水凝膠的力學性能較差；Partlow等［19］使用辣根過氧化物酶（HRP）和過氧化氫（H2O2）促進絲素蛋白交聯，形成水凝膠，但該水凝膠不具備生物活性，無法加速傷口愈合。

本文從桑蠶繭中提取絲素蛋白，對明膠進行改性得到酪胺改性明膠（TG），并采用辣根過氧化物酶（HRP）和過氧化氫（H2O2）使SF和TG產生交聯反應，形成復合水凝膠（SF-TG）；在SF-TG交聯網絡形成過程中摻入堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），形成生物活性水凝膠SF-TG-bFGF；對SF-TG-bFGF進行形貌、力學性能、溶脹性能等的表征及測試，并在體外生理環境中檢測bFGF的釋放能力；評估SF-TG-bFGF促進L929細胞增殖、遷移和膠原蛋白合成的能力。本文為SF-TG-bFGF在生物活性傷口敷料中的應用提供一定的理論指導。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

桑蠶繭（杭州富絲工貿有限公司）；碳酸鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化鈣、鹽酸酪胺（上海麥克林生化科技有限公司）；無水乙醇（分析純AR，杭州高晶精細化工有限公司）；明膠（來自豬皮，A型，Sigma-Aldrich上海貿易有限公司）；嗎啉乙磺酸（上海羅恩化學技術有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，上海麥克林生化科技有限公司）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，上海源葉生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP，上海麥克林生物化學）；過氧化氫（H2O2，上海凌峰化學）；小鼠成纖維細胞（L929，中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）；磷酸鹽緩沖液、DMEM高糖培養液（浙江森瑞生物科技有限公司）；胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液和CCK-8試劑（上海碧云天生物技術有限公司）；堿性成纖維細胞生長因子ELISA試劑盒（96T，江蘇酶免實業有限公司）和羥脯氨酸測定試劑盒（48T，南京建成生物工程研究所）。

1.1.2 實驗儀器

高速冷凍離心機（Biofuge Stratos，美國賽默飛）、真空冷凍干燥機（FD-IA-50，北京博醫康實驗儀器有限公司）、超低溫冰箱（TF-86-30LA，上海田楓機械設備有限公司）、紫外-可見分光光度計（TU-1950，北京普析通用儀器有限公司）、掃描電子顯微鏡（SU8010，日本日立公司）、傅立葉紅外光譜儀（Nicolet is50，美國熱電）、萬能材料試驗機（5943，美國Instron）、雙功能水浴恒溫震蕩器（SHA-B，常州金壇一恒儀器廠）、酶標儀（DR-3518，無錫華衛德朗儀器有限公司）和倒置顯微鏡（37XBZ，上海長方光學儀器有限公司）。

1.2 樣品制備

1.2.1 SF的提取

將1 g桑蠶繭加入到100 mL質量分數為0.5%的碳酸鈉水溶液中，煮沸，30 min后取出，用去離子水沖洗干凈，重復上述步驟6次，完成脫膠過程。將脫膠后的蠶絲放置在60 ℃的烘箱中干燥12 h，稱重，并按照水浴比1∶25加入到氯化鈣混合溶液中（氯化鈣、乙醇和去離子水按摩爾比1∶2∶8混合），在60 ℃下溶解1 h，室溫冷卻后使用8000 Da的透析袋在去離子水中進行透析，每隔6 h更換一次去離子水；透析2 d后，將透析好的SF溶液轉入離心管中，在高速冷凍離心機的條件下（12000 r/min、5 ℃）離心20 min去除雜質，取上清液，冷凍干燥得到純凈的SF。

1.2.2 TG的制備

將質量分數為2%的明膠粉末加入到50 mmol/L的嗎啉乙磺酸溶液中，56 ℃下攪拌，直至充分溶解，待溶液冷卻至室溫后，加入質量分數為1%的鹽酸酪胺，充分攪拌；依次加入質量分數為0.74%的EDC和質量分數為0.22%的NHS，室溫下攪拌、反應12 h，將反應后的混合溶液裝入12000 Da的透析袋，放在去離子水中透析，每隔6 h更換一次去離子水，透析3 d。透析結束后，將混合溶液冷凍干燥，得到TG，保存備用。

1.2.3 SF-TG-bFGF的制備

將質量分數均為8%的TG和SF充分混合，加入混合液體積分數為5%且質量濃度為2.5 μg/mL的bFGF，混勻后加入100 U/mL的HRP溶液，攪拌均勻；加入與HRP溶液相同量的16.5 mmol/L H2O2溶液，37 ℃充分交聯1 h，最終形成負載生長因子的SF-TG-bFGF。

1.3 測試與表征

1.3.1 紫外光譜表征

將改性前后的Gel溶于去離子水，形成質量分數為0.1%的溶液，使用紫外-可見分光光度計測試改性前后Gel的紫外光譜。

1.3.2 形貌表征

利用聚四氟乙烯模具制備直徑和高均為10 mm的水凝膠（SF-TG和SF-TG-bFGF）；然后進行冷凍干燥，形成水凝膠支架；噴金后，利用掃描電子顯微鏡觀察橫截面形貌。

1.3.3 紅外光譜表征

將質量分數均為8%的SF和TG混勻，經過冷凍干燥，得到SF/TG，使用傅立葉紅外光譜儀測試SF、SF/TG和SF-TG的紅外吸收光譜。測試條件：分辨率為4 cm-1，掃描次數為64次，測試波數范圍為4000～400 cm-1。

1.3.4 彈性模量測試

利用聚四氟乙烯模具制備直徑和高均為10 mm的SF-TG-bFGF，采用萬能材料試驗機在室溫下壓縮SF-TG-bFGF，將壓縮速率設為1 mm/min，以SF-TG作為對照，每組5個平行樣。

1.3.5 溶脹性能測試

利用聚四氟乙烯模具制備直徑和高均為10 mm的SF-TG-bFGF，冷凍干燥后，將SF-TG-bFGF浸泡在磷酸鹽緩沖液（PBS）中，分別在0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、9.0、12.0、15.0 h和24.0 h取樣測試其溶脹性能，每組5個平行樣。溶脹率按式（1）計算：

S/%=WsWd×100（1）

其中：S為SF-TG-bFGF的溶脹率，%；Ws為溶脹后SF-TG-bFGF的質量，g；Wd為初始凍干SF-TG-bFGF的質量，g。

1.3.6 bFGF的體外釋放實驗

將2 g SF-TG-bFGF置于西林瓶中，加入2 mL的PBS，將西林瓶放入37 ℃的雙功能水浴恒溫震蕩器中進行孵育，以100 r/min的轉速振搖，分別于3、6、12、24、48、72、96、120 h和144 h取10 μL樣液，每組5個平行樣，按照堿性成纖維細胞生長因子ELISA試劑盒的操作步驟嚴格測定bFGF的含量，計算釋放率。

1.3.7 細胞增殖

用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM高糖培養液，在37 ℃、5% CO2的環境下對L929細胞進行培養。使用96孔板制備高為2 mm的SF-TG-bFGF，并冷凍干燥，將L929細胞以1×104個/孔的密度種于96孔板中，培養過夜，使細胞與孔充分黏附，吸除孔板中舊培養液，加入200 μL新鮮培養液。將制備好的SF-TG-bFGF從孔板中取出，加入到含有細胞的孔板中，以SF-TG作為陰性對照，純細胞作為空白對照，每組5個平行樣，共培養1、2 d和3 d后取出孔板，除去SF-TG、SF-TG-bFGF和殘余培養液，向每孔加入110 μL的CCK-8試劑和新鮮培養液（比例為1∶10），繼續培養2 h，隨后取出孔板，使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。

1.3.8 細胞遷移

使用6孔板制備高為10 mm的SF-TG-bFGF，并冷凍干燥；另取6孔板，在背面每孔用記號筆劃線3條，將L929細胞以2×105個/孔的密度種于6孔板中，培養過夜，使細胞與孔壁充分黏附，用100 μL槍頭垂直于劃線制造劃痕，除去舊培養液，用無菌PBS沖洗細胞3次去除劃痕中的細胞，每孔加入8 mL不含胎牛血清的新鮮培養液。將SF-TG-bFGF加入到含有細胞的孔板中，以SF-TG作為陰性對照，純細胞作為空白對照，每組3個平行樣。利用倒置顯微鏡在0、6、12 h和24 h取樣拍照，用Image J軟件處理遷移圖，細胞遷移率按式（2）計算：

M/%=S0-StS0×100（2）

其中：M為L929細胞的遷移率，%；S0為0 h的原始面積，pixel；St為特定時刻的面積，pixel。

1.3.9 細胞膠原蛋白合成

使用6孔板制備高為10 mm的SF-TG-bFGF，并冷凍干燥。將L929細胞以2×105個/孔的密度種于6孔板中，培養過夜，使細胞與孔壁充分黏附。除去舊培養液，加入4 mL新鮮培養液，將SF-TG-bFGF加入到含有細胞的孔板中，以SF-TG作為陰性對照，純細胞作為空白對照，每組3個平行樣，共培養24 h后每孔收集0.5 mL培養液。按照羥脯氨酸測定試劑盒說明書中的操作步驟和計算公式，嚴格測定培養液在550 nm處的吸光度并計算羥脯氨酸含量，該含量表示培養液中膠原蛋白的質量濃度。

2 結果與討論

2.1 紫外光譜分析

采用紫外-可見分光光度計測試明膠酪胺改性前后的紫外吸收峰，結果如圖1所示。圖1顯示，TG在275 nm處的吸光度明顯高于Gel在275 nm處的吸光度，這是由于EDC/NHS的偶聯作用，活化了Gel中大量存在的羧基，而鹽酸酪胺含有大量酚羥基，從而導致酪胺與明膠內氨基酸殘基中的羧基成功偶聯，形成吸光度更高的TG。正如Sakai等［20］所述，利用EDC/NHS的偶聯作用，可活化明膠羧基并引入酚羥基，獲得酪胺改性的明膠即TG。

2.2 負載bFGF前后的水凝膠形貌分析

對SF-TG和SF-TG-bFGF進行SEM測試，結果如圖2所示。由圖2可知，SF-TG呈現出三維網狀結構，且孔徑密集均勻；負載bFGF后，SF-TG-bFGF的表面變得光滑，且孔狀結構減少，有一些孔向外延展為片狀，其原因可能是占有一定體積的大分子多肽bFGF滯留在了SF-TG的網壁上。因此，將SF-TG-bFGF應用于傷口愈合時，這樣的微觀結構有利于控制濕度和緩慢釋放生長因子，從而保持生長因子的活性［21］。

2.3 紅外光譜分析

SF、SF/TG和SF-TG的紅外光譜如圖3所示。從圖3可見，SF和SF/TG在酰胺Ⅰ區的吸收峰均在1637 cm-1處，而SF-TG的峰發生了偏移，移動至1627 cm-1處，表明SF在形成水凝膠時發生了構象變化。SF的酪氨酸殘基［19］與TG上新形成的酪胺根中都含有酚羥基，酚羥基的鄰位很容易在HRP/H2O2體系下交聯［22］，從而形成水凝膠。

2.4 負載bFGF前后水凝膠的彈性模量

將負載bFGF水凝膠進行壓縮測試，結果如圖4所示。圖4中，SF-TG的彈性模量略高于SF-TG-bFGF，表明bFGF加入后，SF-TG-bFGF的網狀結構有所延展，孔狀結構減少，導致彈性模量略微下降；SF-TG-bFGF仍然保留有基本的三維網絡結構，其彈性模量約為21 kPa。材料硬度對細胞黏附和增殖有顯著影響，細胞在彈性模量低于30 kPa軟基底上表現出更好的細胞黏附和增殖效果，而在彈性模量為30～100 kPa的硬基底上只能保持固有的較低的黏附和增殖［23］。因此，SF-TG-bFGF具有適合不同傷口環境的力學性能，更適合用作傷口敷料。

2.5 SF-TG-bFGF的溶脹率

將SF-TG-bFGF在37 ℃ PBS中浸泡24 h，并通過監測重量變化測定SF-TG-bFGF溶脹率，結果如圖5所示。圖5表明，SF-TG-bFGF在孵育12 h后達到溶脹平衡，溶脹率約700%。在24 h內保持穩定，沒有重量損失。使用絲素蛋白和甲基丙烯酰化明膠形成的復合水凝膠僅具有約400%的溶脹率［24］，溶脹性能差于SF-TG-bFGF。穩定的三維網狀結構可以使水凝膠溶脹性能提高，具備優異的吸濕保濕能力［25］。綜上所述，SF-TG-bFGF溶脹性能非常好，適合用作具有優異吸濕保濕能力的傷口敷料。

2.6 bFGF的體外釋放

在37 ℃ PBS的體外生理條件下，SF-TG-bFGF中bFGF的釋放結果如圖6所示。圖6表明，在水凝膠的負載下，bFGF可以緩慢釋放，在96 h內，釋放率不斷提高，bFGF持續釋放到體外的生理環境中；在96至144 h期間，bFGF持續穩定地釋放，最終釋放率約為81%，He等［18］制備的絲素蛋白水凝膠負載的人酸性成纖維細胞生長因子在80 h釋放率僅為70%，緩釋性能低于SF-TG-bFGF。上述結果表明，SF-TG-bFGF完全適用于缺乏生長因子正向反饋作用的傷口，可作為一種生物活性傷口敷料。

2.7 SF-TG-bFGF對細胞增殖的影響

將L929細胞與不同類型的水凝膠共培養1、2 d和3 d后，采用CCK-8試劑測定細胞增殖情況，結果如圖7所示。圖7表明，共培養1 d后，SF-TG-bFGF的細胞存活率接近200%，是空白對照組的兩倍，同時高出SF-TG 40%，說明SF-TG-bFGF比SF-TG更能促進L929細胞增殖；共培養2 d和3 d后，SF-TG的細胞存活率與空白對照組相近，而SF-TG-bFGF的細胞存活率仍顯著高于空白對照組和SF-TG，存活率高達300%，表明SF-TG此時已經幾乎沒有促進細胞增殖的作用了，而SF-TG-bFGF仍能顯著地促進L929細胞的增殖。上述結果表明，SF-TG-bFGF能加速高密度皮膚組織形成，促進再上皮化。

2.8 SF-TG-bFGF對細胞遷移的影響

不同時間點的細胞遷移如圖8所示。將圖8導入到Image J軟件進行處理，通過像素點的差異計算6、12 h和24 h的細胞遷移率，結果如圖9所示。圖8中，細胞隨時間向劃痕遷移進行愈合，空白對照組直到12 h才有少量細胞遷移；SF-TG在6 h就有少量細胞遷移；SF-TG-bFGF在6 h有大量細胞遷移。結合圖9，空白對照組細胞在24 h遷移率僅有20%，一直處于緩慢遷移狀態，遷移率很低；SF-TG遷移率在24 h為40%，遷移現象不明顯，遷移率較低，表明SG-TG對L929細胞遷移僅有一定的促進作用；而SF-TG-bFGF的遷移率在24 h達到90%，表明SF-TG-bFGF能明顯提高細胞遷移率，加速L929細胞的遷移，Guan等［26］制備的絲素蛋白水凝膠24 h的細胞遷移并不明顯，直到36 h才達到90%的遷移率，對細胞遷移的促進效果低于SF-TG-bFGF。上述結果表明，SF-TG-bFGF能顯著促進皮膚組織細胞的遷移，加速傷口愈合。

2.9 SF-TG-bFGF對細胞膠原蛋白合成的影響

各組培養液中膠原蛋白的質量濃度如圖10所示。SF-TG與空白對照組的膠原蛋白質量濃度相近，約為3.2 μg/mL，說明SF-TG對L929細胞合成膠原蛋白幾乎沒有影響；SF-TG-bFGF的膠原蛋白質量濃度明顯高于前面兩組，達到了4.5 μg/mL，說明SF-TG-bFGF顯著促進了L929細胞合成大量膠原蛋白（圖10）。膠原蛋白為高生理活性細胞和細胞成分提供支架材料，為細胞附著、增殖和分化提供天然基質，有助于促進傷口愈合過程中的血管生成和再上皮化［27］。綜上所述，SF-TG-bFGF通過提高膠原蛋白質量濃度，促進傷口愈合。

3 結 論

本文將絲素蛋白和生物功能材料明膠結合，制備了負載bFGF生長因子的SF-TG-bFGF，得出以下結論：

a）SF-TG具有三維網狀結構，適合負載生長因子；bFGF的體外釋放則進一步說明了SF-TG不僅能負載bFGF生長因子，保護活性，還能緩慢釋放，延長bFGF的半衰期。

b）SF-TG-bFGF在體外生理環境下具有優異的吸濕保濕能力，有利于促進傷口的濕愈合。同時，復合改性明膠使SF-TG-bFGF具有良好的力學性能，可以適應不同傷口環境并保護傷口。

c）SF-TG-bFGF顯著促進了細胞的增殖、遷移和膠原蛋白合成，并具備在皮膚傷口愈合領域廣泛應用的生物活性。

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（責任編輯：張會巍）

收稿日期： 2023-01-07網絡出版日期：2023-05-05網絡出版日期

基金項目： 國家自然科學基金項目（52273096）；浙江省自然科學基金項目（LQ15E030004）

作者簡介： 鄧 明（1999- ），男，湖南衡陽人，碩士研究生，主要從事生物材料方面的研究。

通信作者： 王 秉，E-mail：wbing388@163.com