天冬酰胺類抗體-藥物偶聯物連接子的合成新工藝

林子健　曹小冬

摘 要： 為了提高抗體-藥物偶聯物（Antibody-drug conjugate， ADC）的連接子4-N-（N-（L-丙氨酰-L-丙氨酰）-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基）-氨基苯甲醇（NH2-AAN（Trt）-PAB）的合成效率，設計了一條新的合成路線。以N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺為起始原料，經過氨基酸縮合、氨基脫保護4步反應，高效合成了NH2-AAN（Trt）-PAB。LCMS、1H NMR分析表征結果表明成功合成了NH2-AAN（Trt）-PAB。該研究具有操作簡便、條件溫和可控、合成效率高、總產率較高等特點，有利于NH2-AAN（Trt）-PAB的放大生產及其在ADC藥物研發中的應用，同時對其他蛋白酶可裂解連接子的合成具有借鑒意義。

關鍵詞： 抗體-藥物偶聯物；連接子；天冬酰胺；氨基酸縮合；氨基脫保護；可裂解連接子

中圖分類號： O622.6

文獻標志碼： A

文章編號： 1673-3851 （2023） 09-0612-06

引文格式：林子健，曹小冬. 天冬酰胺類抗體-藥物偶聯物連接子的合成新工藝［J］. 浙江理工大學學報（自然科學），2023，49（5）：612-617.

Reference Format： LIN Zijian， CAO Xiaodong. A novel synthetic technology of asparagine antibody-drug conjugate linker［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（5）：612-617.

A novel synthetic technology of asparagine antibody-drug conjugate linker

LIN Zijian， CAO Xiaodong

（School of Science， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract： To improve the synthesis efficiency of the linker NH2-AAN（Trt）-PAB of antibody-drug conjugate （ADC）， we designed a new synthetic route. With Fmoc-Asn（Trt）-OH as the raw material， NH2-AAN（Trt）-PAB was efficiently synthesized through four steps including amino acid condensation and amino deprotection. The results of LCMS and 1H NMR analysis indicate the successful synthesis of NH2-AAN（Trt）-PAB. This synthesis route has many advantages， such as simple operation， mild condition， high efficiency， and high yield， which is conducive to the scale-up production of NH2-AAN（Trt）-PAB and its application in ADC drug research and development. It has reference significance for the synthesis of other protease cleavable linkers.

Key words： ?ADC; linker; asparaginate; amino acid condensation; amino deprotection; cleavable linker

0 引 言

抗體偶聯藥物（Antibody drug conjugate， ADC）是由靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細胞毒性藥物通過連接子連接而成，具有傳統小分子化療的強大殺傷效應和抗體藥物的腫瘤靶向性［1-3］。隨著ADC開發技術的迭代和臨床試驗的積累，偶聯連接子已被公認是整個ADC設計的關鍵要素，在抗體-藥物偶聯物的合成過程中起著至關重要的作用［4-6］。

4-N-（N-（L-丙氨酰-L-丙氨酰）-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基）-氨基苯甲醇（NH2-AAN（Trt）-PAB）是合成新一代抗體-藥物偶聯物的連接子。由于其具有優越的體內穩定性以及能夠在腫瘤細胞內快速裂解釋放藥物等特點，成功應用于多種新型偶聯藥物的開發中，尤其是抗體-藥物偶聯物的開發［7］。許多使用NH2-AAN（Trt）-PAB的抗體-藥物偶聯物在腫瘤模型中顯示出優異的抗腫瘤療效［8-11］。

NH2-AAN（Trt）-PAB的合成方法通常以N-芐氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺和N-叔丁氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺作為起始原料，經過2次氨基酸縮合以及2次氨基脫保護得到目標產物。然而，通過多次重復文獻［12-13］報道的合成路線，發現這兩條路線中存在很多問題：a） 在以N-芐氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺作為起始原料的合成路線中，采用苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）為縮合試劑，在此條件下反應需要過夜、反應時間較長；其次，該路線采用N，N-二甲基甲酰胺（DMF）為縮合反應的溶劑，反應完成后用乙醚打漿，反應產生的雜質無法完全除去。該合成路線耗時較長且純化困難，最終的合成收率較低，且乙醚安全系數低，對大量生產不利。b） 在以N-叔丁氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺作為起始原料的合成路線中，第二步采用三氟乙酸脫去叔丁氧羰基，這一過程會有大量副產物產生，導致純化困難，最終收率不高。

針對上述情況，本文設計了一條NH2-AAN（Trt）-PAB的合成新路線，即以N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺為起始原料，經過氨基酸縮合、氨基脫保護4步反應，高效合成NH2-AAN（Trt）-PAB，并通過優化反應條件得到最佳合成路線。采用LCMS、1H-NMR對產物的結構進行表征和分析。該合成新路線具有操作簡便、條件溫和可控、合成效率高、總產率較高等特點，有利于NH2-AAN（Trt）-PAB的放大生產及其在ADC藥物研發中的應用，同時對其他蛋白酶可裂解連接子的合成具有借鑒意義。

1 實驗部分

1.1 實驗主要材料

四氫呋喃（THF）、二氯甲烷（DCM）、甲醇（MeOH）、二甲胺（DMA）、哌啶（Piperidine）和甲基叔丁基醚等均為分析純，購于上海炎澤化工有限公司；N，N-二異丙基乙胺（DIPEA）為分析純，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺、對氨基芐醇、N-（N-芴甲氧羰基-L-丙氨酰）-L-丙氨酸、2-（7-氮雜苯并三氮唑）-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）、N′N-二環已基碳二亞胺（DCC）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）購于上海麥克林生化科技股份有限公司；TLC薄層板購于天津市北聯精細化學品開發有限公司。

1.2 實驗主要儀器

AVANCE AV400 MHz型核磁共振波譜儀、Micromass Quattro Micro液質聯用質譜儀、Biotage Isolera Prime型快速制備液相色譜和UV-2600型紫外分光光度儀。

1.3 天冬酰胺類連接子NH2-AAN（Trt）-PAB的合成

以N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺為起始原料，經過氨基酸縮合、氨基脫保護基四步反應合成天冬酰胺類連接子NH2-AAN（Trt）-PAB（5），合成路線如圖1所示。

1.3.1 中間體（2）的合成

將20.00 g （33.52 mmol）N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺溶于THF （240.0 mL）中，加入19.12 g （50.28 mmol）HATU和14.1 mL （83.80 mmol）DIPEA。隨后，在混合物中加入4.12 g （33.52 mmol）對氨基芐醇，在室溫下攪拌1 h。反應完成后用DCM 萃取溶液，將溶液干燥和濃縮，然后用硅膠色譜柱進行純化（MeOH與DCM的體積比為1∶10），得到19.50 g白色固體產物。產物為中間體（2），產率83%，LCMS［M+H］+=703。

1H NMR （400 MHz， DMSO） δ 10.01 （s， 1H）， 8.59 （s， 1H）， 7.90 （d， J=7.5 Hz， 2H）， 7.74 （d， J=7.9 Hz， 4H）， 7.33～7.12 （m， 22H）， 5.09 （t， J=5.7 Hz， 1H）， 4.43 （d， J=5.6 Hz， 1H）， 4.19 （d， J=5.7 Hz， 2H）， 3.31 （d， J=5.5 Hz， 3H）， 2.68 （q， J=5.3 Hz， 2H）。

1.3.2 中間體（3）的合成

將19.50 g （27.78 mmol）中間體（2）加入DMA （100.0 mL）中，在室溫下攪拌30 min。反應完成后用DCM萃取溶液，之后將溶液干燥濃縮，加入甲基叔丁基醚 （100.0 mL）并洗滌3次。洗滌完成后倒出甲基叔丁基醚層，烘干，得到11.40 g白色固體產物。產物為中間體（3），產率86%，LCMS［M+H］+=480。

1H NMR （400 MHz， DMSO） δ 9.25 （s， 1H）， 8.76 （s， 2H）， 8.18 （s， 1H）， 7.56 （d， J=7.5 Hz， 2H）， 7.28～7.14 （m， 17H）， 5.09 （t， J=5.7 Hz， 1H）， 4.43 （d， J=5.7 Hz， 2H）， 3.66 （dd， J=8.2， 5.1 Hz， 1H）， 2.65 （q， J=5.3 Hz， 2H）。

1.3.3 中間體（4）的合成

將11.40 g （23.77 mmol）中間體（3）溶于THF （240.0 mL）中，加入10.84 g （28.52 mmol）HATU和8.0 mL （47.54 mmol）DIPEA。隨后，在混合物中加入9.09 g （23.77 mmol）N-（N-芴甲氧羰基-L-丙氨酰）-L-丙氨酸，混合物在室溫下攪拌1 h。反應完成后將溶液干燥和濃縮，然后用硅膠色譜柱進行純化（MeOH與DCM的體積比為3∶5），得到16.65 g淺黃色固體產物。產物為中間體（4），產率83%，LCMS［M+H］+=845。

1H NMR （400 MHz， DMSO） δ 9.72 （s， 1H）， 8.68 （s， 2H）， 8.20 （t， J=16.4 Hz， 1H）， 7.88 （d， J=7.6 Hz， 2H）， 7.62～7.51 （m， 4H）， 7.42～7.07 （m， 22H）， 5.75 （s， 1H）， 5.12～5.02 （m， 1H）， 4.64 （dd， J=14.1， 7.6 Hz， 4H）， 4.44 （d， J=5.6 Hz， 3H）， 2.80～2.62 （m， 2H）， 1.23 （ddd， J=24.3， 11.4， 5.1 Hz， 6H）。

1.3.4 NH2-AAN（Trt）-PAB（5）的合成

將16.65 g （19.73 mmol）中間體（4）加入DMA （180.0 mL）中，在室溫下攪拌1 h。反應完成后將溶液干燥濃縮，加入甲基叔丁基醚（100.0 mL）并洗滌3次，洗滌完成后倒出甲基叔丁基醚層，烘干，得到10.43 g淡黃色固體產物。產物為NH2-AAN（Trt）-PAB（5），產率85%，LCMS［M+H］+=623。

1H NMR （400 MHz， DMSO） δ 9.77 （s， 1H）， 8.69 （s， 2H）， 8.36 （d， J=5.3 Hz， 2H）， 8.35 （s， 1H）， 7.59 （d， J = 8.4 Hz， 2H）， 7.28～7.13 （m， 17H）， 5.09 （s， 1H）， 4.64 （dd， J=13.7， 8.0 Hz， 1H）， 4.44 （s， 1H）， 4.33 （d， J=6.5 Hz， 2H）， 3.67 （s， 1H）， 2.74～2.64 （m， 2H）， 1.20 （d， J=6.9 Hz， 3H）， 1.09 （d， J=7.0 Hz， 3H）。

1.4 測試與表征

1.4.1 質譜測試

用乙腈作為流動相，采用液質聯用質譜儀測試天冬酰胺類連接子合成過程中中間體（2）、（3）、（4）以及目標產物（5）的質譜。

制樣方法：取待測樣品5 mg于離心管中，加入乙腈1 mL，超聲助溶，用濾頭過濾制得待測試濾液樣品。

1.4.2 薄層層析法（TLC）

將待分析樣品5 mg溶解于1 mL THF，然后用毛細管在TLC薄層板上點樣，隨后在甲醇和二氯甲烷配置的展開劑上進行展開（甲醇與二氯甲烷的體積比例為1∶10）。最后TLC薄層板在254 nm紫外燈下找出吸收斑點。

2 結果與討論

2.1 中間體（2）、（3）、（4）和NH2-AAN（Trt）-PAB（5）的質譜分析

對中間體（2）、（3）、（4）和NH2-AAN（Trt）-PAB（5）進行質譜分析測試，結果如圖2所示。由圖2（a）可知：在質譜正離子模式下中間體（2）出現較強的［M+H］+分子離子峰m/z 703，與中間體（2）的理論分子量701.82相吻合。由圖2（b）可知：在質譜正離子模式下中間體（3）出現較強的［M+H］+分子離子峰m/z 481，與中間體（3）的理論分子量479.58相吻合。由圖2（c）可知：在質譜正離子模式下中間體（4）出現較強的［M+H］+分子離子峰m/z 845，與中間體（4）的理論分子量843.98相吻合。圖2（d）可知：在質譜正離子模式下出現較強的［M+H］+分子離子峰m/z 623，與NH2-AAN（Trt）-PAB（5）的理論分子量621.74相吻合。

2.2 NH2-AAN（Trt）-PAB（5）的核磁譜圖

采用核磁氫譜對NH2-AAN（Trt）-PAB（5）進行核磁表征，結果如圖3所示。根據峰的位置、裂分情況、耦合常數和氫的個數可以確定為目標產物。

2.3 天冬酰胺類連接子NH2-AAN（Trt）-PAB的合成過程分析

本文嘗試多種起始原料進行反應合成NH2-AAN（Trt）-PAB，發現以N-芐氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺和N-叔丁氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺作為起始原料的反應均存在副產物較多、純度低、收率低的問題。而在以N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺作為起始原料的合成路線中，純化難度大大降低、產物的純度和收率顯著提升。因此本文選用N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺作為起始原料進行反應。第一步為N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺與對氨基芐醇的縮合過程，本文嘗試了多種縮合試劑，最終確定以HATU為縮合試劑，該步驟反應迅速，產率良好，避免了在HBTU條件下耗時長的問題，大大提高了合成效率。且第一步選用THF作為溶劑，后處理過程中雜質容易除去，避免了以DMF作為溶劑后處理困難的問題。第二步為中間體（2）氨基脫保護的過程，由于芴甲氧羰基為堿敏感保護基，這步嘗試了多種脫保護基的條件，發現在二甲胺的條件下反應優良，后處理的過程中選用甲基叔丁基醚對產物進行洗滌操作，避免了乙醚安全系數低的問題。第三步為中間體（3）接二肽的過程，也是該合成路線中最關鍵的一步，嘗試了多種縮合條件，在以HATU為縮合試劑的條件下有著良好的收率。最后一步為中間體（4）脫氨基保護基的過程，在二甲胺的條件下有著良好的收率。通過優化反應條件，目標產物的總產率可達50%。

2.4 反應條件對縮合反應的影響

化合物（3）與N-（N-芴甲氧羰基-L-丙氨酰）-L-丙氨酸反應合成中間體（4）是合成NH2-AAN（Trt）-PAB的關鍵步驟。在反應條件的篩選中，發現縮合劑及時間對結果有重要的影響，結果如表1所示。由表1可以看出：以DCC和EDCI作為縮合劑時，產率較低，以HATU做縮合劑時有較高的收率；在以HATU作為縮合劑的條件下，隨著反應的進行產率逐漸提高，當反應進行1 h產率達到83%，最佳條件為以HATU作為縮合劑在四氫呋喃溶液中反應1 h。

2.5 反應條件對脫芴甲氧羰基的影響

中間體（4）脫芴甲氧羰基的過程中嘗試了多種條件，發現堿的選擇以及反應時間對反應有著重要的影響，結果如表2所示。由表2可以看出：中間體（4）在Piperidine和DIPEA的條件下反應30 min有一定的脫除效果，但這2種試劑不是最理想的堿性試劑；中間體（4）在DMA的條件下反應30 min，可以達到較高的產率，且隨著反應時間的進行，產率不再增加，因此反應的最佳條件為以THF作為溶劑，在DMA的條件下反應30 min。

3 結 論

本文以N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺為起始原料，經過氨基酸縮合、氨基脫保護四步反應，高效合成天冬酰胺類抗體-藥物偶聯物連接子NH2-AAN（Trt）-PAB，對合成工藝進行優化，并對NH2-AAN（Trt）-PAB進行表征，主要得出以下結論：

a）合成了天冬酰胺類抗體-藥物偶聯物連接子NH2-AAN（Trt）-PAB，通過核磁氫譜和質譜證明了目標產物的成功合成，總產率為50%。

b）優化的合成工藝中氨基酸縮合的條件為THF作溶劑、DIPEA作堿、HATU作縮合劑；氨基脫芴甲氧羰基的條件為THF作溶劑、DMA作堿。

新合成路線具有高效、安全性高、操作簡便以及產品純度高等特點，適合放大生產，該路線對其他三肽類連接子的合成具有借鑒意義。

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（責任編輯：張會巍）

收稿日期： 2023-05-03網絡出版日期：2023-06-07

作者簡介： 林子健（1997- ），男，安徽宣城人，碩士研究生，主要從事有機合成方面的研究。

通信作者： 曹小冬，sheidon.cao@eubulusbio.com