HSP90抑制劑前藥設計及合成

劉文金　曹小冬

摘 要： 為解決熱休克蛋白90（Heat shock protein 90，HSP90）抑制劑的周身毒性問題，自主設計并合成了兩個HSP90抑制劑的三肽前藥P1和P2。以4-（2-羥乙基）哌啶-1-甲酸叔丁酯和1-（溴甲基）-4-硝基苯為起始原料，經羥胺縮合、硝基還原、關環等反應合成HSP90抑制劑HSP90i-1和HSP90i-2；以L-脯氨酸和L-纈氨酸衍生物為原料，經縮合、脫保護、酰化等反應合成多肽連接子M1。將HSP90i-1、HSP90i-2分別和M1縮合，得到兩個三肽前藥P1和P2。1H NMR、LCMS、13C NMR分析表征結果表明成功合成了兩個前藥分子兩個前藥分子被成功合成。該研究具有使用的原料廉價易得、反應都在常溫下進行、條件溫和可控、總產率較高等特點，為多肽前藥的設計及合成提供了新的思路和方法。

關鍵詞： HSP90抑制劑；前藥；縮合；酰化；多肽前藥

中圖分類號： O622.6

文獻標志碼： A

文章編號： 1673-3851 （2023） 09-0604-08

引文格式：劉文金，曹小冬. HSP90抑制劑前藥設計及合成［J］. 浙江理工大學學報（自然科學），2023，49（5）：604-611.

Reference Format： LIU Wenjin， CAO Xiaodong. Design and synthesis of HSP90 inhibitor prodrugs［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（5）：604-611.

Design and synthesis of HSP90 inhibitor prodrugs

LIU Wenjin， CAO Xiaodong

（School of Science， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract： ?To solve the peripheral toxicity problem of heat shock protein 90 （HSP90） inhibitors， we designed and synthesized two HSP90 inhibitors， P1 and P2， as tripeptide prodrugs. The HSP90 inhibitors HSP90i-1 and HSP90i-2 were synthesized from tert-Butyl 4-（2-hydroxyethyl） piperidine-1-carboxylate and 1-Bromo-4-nitrobenzene by the reactions of hydroxylamine condensation， nitroreduction， ring closure， etc. The peptide linker M1 was synthesized from L-proline and L-valine derivatives by the reactions of condensation， deprotection， acylation， etc. HSP90i-1 and HSP90i-2 were condensed with M1 to obtain the two tripeptide prodrugs of P1 and P2.1H NMR， LCMS，13C NMR analysis and characterization results indicated that the two prodrugs were successfully synthesized. The study is characterized by the availability of inexpensive raw materials， the mild and controlled conditions of the reactions at room temperature， and the high overall yields， which provides new ideas and methods for the design and synthesis of polypeptide prodrugs.

Key words： HSP90 inhibitor; prodrug; condensation; acylation; polypeptide prodrug

0 引 言

熱休克蛋白90（Heat shock protein 90，HSP90）是一種癌癥治療靶點，近年來備受關注。HSP90通過與客戶蛋白和輔助分子伴侶的相互作用調節細胞內的信號通路、蛋白質穩態和細胞凋亡過程。通常，HSP90可用于保持400多個蛋白的構象穩定，同時也是癌細胞生長和轉移的關鍵調節因子，能促進瘤細胞運動、侵襲和轉移［1］。HSP90治療靶點發現至今已有三十多年時間，盡管有三十多個HSP90抑制劑進入了臨床研究，但都因安全性問題宣告失敗［2-3］。Synta公司研發的Ganetespib，在前期研究中對非小細胞肺癌表現出良好的治療效果，卻在臨床三期試驗中因毒性而終止后續研究［4］。前藥策略是將母藥分子進行化學結構修飾，使活性母藥與某些功能基團以共價鍵相連，在體內經由某些生物酶的作用釋放出母藥，從而達到較好的藥效。前藥策略在藥物開發過程中被廣泛應用，如用于提高口服藥物的生物利用度、增強藥物的血腦屏障滲透性、增強藥物化學代謝以及母藥的靶向遞送等［5-8］。將前藥策略用于母藥的靶向遞送，在抗腫瘤藥物開發領域極具前景，能夠極大地提高藥物的安全性。

HSP90抑制劑的毒性主要來源于兩個方面：一方面是由于藥物進入體內循環后，在各個器官廣泛分布，對正常組織的HSP90蛋白功能產生抑制作用，從而誘發周身毒性；另外，進入臨床的HSP90抑制劑的選擇性過大，尤其對HSP90蛋白家族的其他亞型也都有較強的抑制作用，不可避免地產生脫靶毒性。因此，HSP90亞型選擇性抑制劑的開發已經成為一個重要的研究方向。然而，HSP90的蛋白結構高度保守，這使得開發選擇性抑制劑異常困難［9-14］。

本文以4-（2-羥乙基）哌啶-1-甲酸叔丁酯和1-（溴甲基）-4-硝基苯為起始原料，經縮合、還原、關環等多步反應得到兩個HSP90抑制劑HSP90i-1和HSP90i-2；以L-脯氨酸和L-纈氨酸衍生物為原料，經過縮合、脫保護、酰化反應得到三肽連接子M1。將M1分別與HSP90i-1和HSP90i-2縮合，得到三肽前藥分子P1和P2。利用1H NMR、LCMS、13C NMR等分析中間體及目標分子的結構。本文的研究可為三肽類前藥提供新的設計思路和合成方法。

1 實驗部分

1.1 實驗材料及儀器

實驗材料：N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、四氫呋喃（THF）、甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH），三氟乙酸（TFA）均為分析純，購于上海安耐吉化學有限公司；4-二甲氨基吡啶（DMAP）、鹽酸二惡烷（HCl）、1-羥基-7-氮雜苯并三氮唑（HOAT）、2-（7-氮雜苯并三氮唑）-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1，2-二氫喹啉（EEDQ）、對氨基芐醇（PAB）、N -乙基二異丙胺（DIEA）、三乙胺（TEA）、對硝基氯甲酸苯酯、對甲苯磺酰氯（TsCl）、氫化鈉（NaH）、鈀碳（Pd/C）、碳酸鈉（Na2CO3）、羰基二咪唑（CDI）、水合肼（NH2-NH2·H2O），均為分析純，購于上海畢得醫藥。

實驗儀器：Bruker Avance AV（400 MHz）核磁共振波譜儀，Biotage LCQ-Fleet質譜儀，waters Biotage Isolera Prime快速制備液相色譜，島津 UV-2600紫外分光光度儀。

1.2 抑制劑HSP90i-1合成

目標分子的合成路線見圖1。4-（2-羥乙基）哌啶-1-甲酸叔丁酯經TsCl活化羥基、羥胺縮合、硝基還原、關環和脫保護［15］等步驟合成4-（5-羥基-4-（1-（2-（哌啶-4-基）乙基）-1H-吲哚-5-基）-4H-1，2，4-三唑-3-基）-6-異丙基苯-1，3-二醇（HSP90i-1）。1H NMR （400 MHz， DMSO） δ 11.90 （s， 1H）， 9.07 （d， J=8.7 Hz， 1H）， 8.88 （d， J=9.4 Hz， 1H）， 7.50～7.45 （m， 2H）， 7.43 （d， J=1.9 Hz， 1H）， 6.93 （dd， J=8.7， 1.9 Hz， 1H）， 6.69 （s， 1H）， 6.43 （d， J=3.0 Hz， 1H）， 6.32 （s， 1H）， 4.21 （t， J=7.1 Hz， 2H）， 3.22～3.16 （m， 2H）， 2.89 （m， 1H）， 2.75 （q， J=11.7 Hz， 2H）， 1.83 （d， J=12.6 Hz， 2H）， 1.68 （q， J=13.5， 6.7 Hz， 2H）， 1.49～1.32 （m， 3H）， 0.81 （d， J=6.9 Hz， 6H）。LCMS［M+H］+=462.3。

1.3 抑制劑HSP90i-2的合成

目標分子的合成路線見圖2。將1-（溴甲基）-4-硝基苯經取代、還原、縮合、關環和脫保護等步驟合成4-（5-羥基-4-（4-（哌嗪-1-基甲基）苯基）-4H-1，2，4-三唑-3-基）-6-異丙基苯-1，3-二醇（HSP90i-2）。1H NMR （401 MHz， DMSO） δ 11.92 （s， 1H）， 9.51 （d， J=82.9 Hz， 2H）， 7.73～5.65 （m， 6H）， 3.46 （s， 2H）， 3.29 （s， 4H）， 3.06～2.87 （m， 1H）， 2.62～2.18 （m， 43H）， 1.38 （s， 9H）， 0.94 （d， J=6.9 Hz， 6H）。LCMS［M+H］+=410.1。

1.4 三肽連接子M1合成

目標分子的合成需經歷5步反應，具體合成路線見圖3。

1.4.1 M1b合成

將L-纈氨酸衍生物（M1a，0.9 g， 2.95 mmol）溶于DMF（20 mL），加入脯氨酸（0.3 g， 2.95 mmol）和碳酸鈉（0.5 g， 4.43 mmol），室溫反應16 h。加水（10 mL），用乙酸乙酯（50 mL×4）萃取，無水硫酸鈉干燥有機層，減壓濃縮，得白色固體（672.0 mg， 收率：75%）。LCMS［M+H］+=259.1。

1.4.2 M1c合成

將M1b（0.5 g， 1.59 mmol）和PAB（0.2 g， 1.75 mmol）加入二氯甲烷（20 mL），加入EEDQ（0.8 g， 3.18 mmol），室溫反應3 h。減壓濃縮，硅膠色譜法純化（PE/EtOAc=7/3PE與EtOAc比值為7∶3）得白色固體（513.0 mg， 收率：77%）。LCMS［M+H］+=420.2。

1.4.3 M1d合成

將M1c（0.6 g， 1.43 mmol）加入二氯甲烷（20 mL），加入三氟乙酸（0.4 mL， 4.30 mmol），室溫反應3 h。減壓濃縮，硅膠色譜法純化（PE/EtOAc=4/1PE與EtOAc比值為4∶1）得白色固體（379.0 mg， 收率：80%）。LCMS［M+H］+=320.2。

1.4.4 M1e合成

將M1d（0.1 g， 1.30 mmol）溶于二氯甲烷（10 mL），加入M1a（0.2 g， 1.40 mmol）和三乙胺（0.3 mL， 1.95 mmol），室溫反應3 h。加水（5 mL），用乙酸乙酯（20 mL×4）萃取，無水硫酸鈉干燥有機層，減壓濃縮，得白色固體（110 mg， 收率：69%）。1H NMR （401 MHz， DMSO） δ 10.15～9.67 （m， 1H）， 7.77 （d， J=8.3 Hz， 1H）， 7.66～7.41 （m， 2H）， 7.23 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 6.84 （dd， J=23.6， 9.2 Hz， 1H）， 5.76 （s， 2H）， 5.09 （t， J=5.6 Hz， 1H）， 4.42 （d， J=5.2 Hz， 4H）， 3.92～3.71 （m， 2H）， 3.63 （d， J=6.7 Hz， 1H）， 2.12 （d， J=8.5 Hz， 1H）， 2.06～1.79 （m， 5H）， 1.38 （s， 11H）， 0.97～0.69 （m， 13H）。LCMS［M+H］+=519.3。

1.4.5 M1合成

將M1e（0.4 g， 1.30 mmol）溶于二氯甲烷（10 mL），加入對硝基氯甲酸苯酯（39.0 mg， 0.19 mmol），加入三乙胺（1.0 mL， 0.38 mmol），室溫反應2 h。加水（5 mL），用乙酸乙酯（20 mL×4）萃取，無水硫酸鈉干燥有機層，減壓濃縮，得白色固體（441.9 mg， 收率：84%）。LCMS［M+H］+=628.3。

1.5 三肽前藥P1的合成

目標分子的合成路線見圖4。將HSP90i-1（80.0 mg， 0.17 mmol）溶于DMF（10 mL），加入M1（118.0 mg， 0.17 mmol）和HOAT（34.7 mg， 0.23 mmol），加入DIEA（41.0 mg， 0.34 mmol），在30 ℃反應4 h。減壓濃縮，硅膠色譜法純化（PE/EtOAc=7/3PE與EtOAc比值為7∶3）得白色固體（123.8 mg， 收率：71%）。1H NMR （401 MHz， DMSO） δ 11.87 （s， 1H）， 10.06 （s， 1H）， 9.52 （d， J=16.2 Hz， 2H）， 7.77 （d， J=8.8 Hz， 1H）， 7.47 （ddd， J=23.6， 14.1， 5.2 Hz， 5H）， 7.28 （d， J=8.6 Hz， 2H）， 6.93 （dd， J=8.6， 2.0 Hz， 1H）， 6.81 （d， J=9.5 Hz， 1H）， 6.68 （s， 1H）， 6.42 （d， J=3.0 Hz， 1H）， 6.23 （s， 1H）， 4.98 （s， 2H）， 4.38 （dd， J=15.9， 7.2 Hz， 2H）， 4.20 （s， 2H）， 3.95 （d， J=11.1 Hz， 2H）， 3.82 （s， 2H）， 3.63 （s， 1H）， 2.95～2.77 （m， 1H）， 2.10～1.79 （m， 6H）， 1.67 （d， J=6.5 Hz， 4H）， 1.38 （s， 11H）， 1.17～0.99 （m， 3H）， 0.98～0.85 （m， 7H）， 0.80 （dd， J=12.7， 6.9 Hz， 12H）。LCMS［M+H］+=963.5。

1.6 三肽前藥P2的合成

目標分子的合成路線見圖5。將HSP90i-2（100.0 mg， 0.24 mmol）溶于DMF（10 mL），加入M1（167.0 mg， 0.24 mmol）和HOAT（49.0 mg， 0.36 mmol），加入DIEA（57.9 mg， 0.48 mmol），在30℃反應4 h。減壓濃縮，硅膠色譜法純化（PE/EtOAc=7/3PE與EtOAc比值為7∶3）得白色固體（158.5 mg， 收率：68%）。1H NMR （401 MHz， DMSO） δ 11.91 （s， 1H）， 10.10 （d， J=23.2 Hz， 1H）， 9.58 （s， 1H）， 9.38 （s， 1H）， 7.77 （d， J=8.9 Hz， 1H）， 7.56 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 7.29 （dd， J=8.4， 4.6 Hz， 4H）， 7.13 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 6.89～6.66 （m， 2H）， 6.25 （s， 1H）， 4.99 （s， 2H）， 4.39 （dt， J=17.0， 8.3 Hz， 2H）， 3.82 （s， 2H）， 3.64 （s， 1H）， 3.46 （s， 3H）， 3.07～2.85 （m， 1H）， 2.76～2.59 （m， 2H）， 2.38-2.23 （m， 7H）， 2.20～1.74 （m， 6H）， 1.38 （s， 9H）， 1.03～0.69 （m， 18H）。LCMS［M+H］+=954.2。

2 結果與討論

2.1 M1的合成過程分析

對M1進行質譜分析測試，結果如圖6所示。在三肽連接子M1的合成過程中，M1a和脯氨酸在DMF和Na2CO3條件下進行縮合，得到M1b。該氨基酸縮合反應條件溫和，特異性高［16］，收率為75%。圖6（a）展示了M1b在液相質譜ESI正模式下測試所得的譜圖；由圖6（a）可知其中：橫坐標為化合物的摩爾質量，單位為（g/mol），表示化合物的分子質量；縱坐標為熒光強度，用a.u.表示，表示化合物吸收強度。測得離子峰［M+H］+=259.1，因結構中包含Boc，由此推斷所測樣品中化合物分子量為259.1+56，與目標產物M1b的理論分子質量314.1一致。

由于無保護的二肽很容易發生自身縮合，形成穩定的哌嗪二酮結構［17］，故在引入第三個氨基酸之前，先與M1b的羧基反應，即M1b和對氨基芐醇反應得到二肽的苯酰胺衍生物M1c，純化后產物收率為77%。圖6（b）展示了M1c在液相質譜ESI正模式下測試所得的譜圖；由圖6（b）可知，測得離子峰［M+H］+=420.3，與目標產物M1c的理論分子質量419.3一致。

M1c在DCM中用TFA脫去氨基保護基Boc，得到N端未保護的二肽M1d，收率80%。圖6（c）展示了M1d在液相質譜ESI正模式下測試所得的譜圖；由圖6（c）可知，測得離子峰［M+H］+=320.2，與目標產物M1d的理論分子質量319.2一致。

M1d中的氨基與M1a的活性酯部分高效縮合得到三肽苯酰胺衍生物M1e，收率為69%。圖6（d）展示了M1e在液相質譜ESI正模式下測試所得的譜圖；由圖6（d）可知，測得離子峰［M+H］+=519.3，與目標產物M1e的理論分子質量518.3一致。

M1e與對硝基氯甲酸苯酯發生酰化反應，得到穩定的三肽苯酰胺活性酯衍生物M1，收率84%，該路線總產率為27%。圖6（e）展示了M1在液相質譜ESI正模式下測試所得的譜圖；由圖6（e）可知，測得離子峰［M+H］+=628.3，因結構中包含Boc，由此推斷所測樣品中化合物分子量為628.3+56，與目標產物M1的理論分子質量683.3一致，確定為目標化合物。

2.2 P1和P2合成過程分析

將含有二級胺官能團的HSP90抑制劑分別與含有活性酯的三肽連接子縮合，得到兩個三肽前藥P1和P2。反應路線簡短，條件溫和，產品收率較高，為三肽類藥物的合成提供了新的方法。

2.2.1 P1液相質譜分析

采用液相質譜（LCMS）對P1進行質譜分析，分析結果如圖7（a）所示，測得離子峰［M+H］+=963.5，因結構中包含Boc，由此推斷所測樣品中化合物分子量為963.5+43，與所設計目標產物P1的相對分子質量1005.5相吻合，確定為目標化合物。

2.2.2 P1核磁氫譜分析

采用核磁氫譜（1H NMR）對P1進行氫譜分析見圖7（b），P1分子式為C54H71N9O10，圖中氫的個數為71，1、2、3位置的3個氫為3個羥基峰，4、5位置的6個氫為異丙基的兩個甲基的氫，6、7、8、9位置的12個氫為另外4個甲基的氫，因此可以確定為目標化合物

2.2.3 P2液相質譜分析

采用液相質譜（LCMS）對P2進行質譜分析，分析結果如圖8（a）所示。測得離子峰［M+H］+=954.5，與所設計的目標產物P2的相對分子質量953.5相吻合，確定為目標化合物。

2.2.4 P2核磁氫譜分析

采用核磁氫譜（1H NMR）對P2進行氫譜分析，結果見圖8（b）。P2分子式為C50H67N9O10，圖中氫的個數為50，1、2、3位置的3個氫為3個羥基峰，4、5、6、7、8、9位置的18個氫為6個甲基的氫，由此可以確定為目標化合物。

2.2.5 P1和P2核磁碳譜分析

核磁碳譜（13C NMR）對P1和P2進行碳譜分析見圖9，根據碳的位置和數量可以確定為目標化合物。

3 結 論

本文先通過多步反應得到HSP90i-1和HSP90i-2兩種HSP90抑制劑，隨后分別與三肽連接子M1進行縮合反應，得到三肽前藥分子P1和P2。合成三肽連接子M1的總產率為27%，通過1H NMR、LCMS、13C NMR證明成功合成了目標化合物。本文提出的整個合成路線所使用的原料廉價易得，反應都在常溫下進行，條件溫和可控，總產率較高。本研究對HSP90抑制劑的毒性問題進行分析，利用前藥方法優化化合物的結構，從而達到降低藥物毒性，提高藥物安全窗的目的，對抗腫瘤藥物的發展有著重要的實踐意義。

參考文獻：

［1］Li Y Y， Zhang T， Schwartz S J， et al. New developments in Hsp90 inhibitors as anti-cancer therapeutics： Mechanisms， clinical perspective and more potential［J］. Drug Resistance Updates， 2009， 12（1/2）： 17-27.

［2］Sidera K， Patsavoudi E. HSP90 inhibitors： Current development and potential in cancer therapy［J］. Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery， 2013， 9（1）： 1-20.

［3］Alarcon S V， Mollapour M， Lee M J， et al. Tumor-intrinsic and tumor-extrinsic factors impacting hsp90- targeted therapy［J］. Current Molecular Medicine， 2012， 12（9）： 1125-1141.

［4］張鐘元， 閻愛俠. Hsp90抑制劑的研究進展［J］. 中國醫藥生物技術， 2021， 16（1）： 41-50.

［5］Shrestha L， Bolaender A， Patel H J， et al. Heat shock protein （HSP） drug discovery and development： Targeting heat shock proteins in disease［J］. Current Topics in Medicinal Chemistry， 2016， 16（25）： 2753-2764.

［6］Liu N X， Chen Q H， Zhang Q Q， et al. The application of prodrug-based drug delivery strategy in anticancer drugs［J］. Current Topics in Medicinal Chemistry， 2021， 21（24）： 2184-2204.

［7］Zawilska J B， Wojcieszak J， Olejniczak A B. Prodrugs： A challenge for the drug development［J］. Pharmacological Reports， 2013， 65（1）： 1-14.

［8］Zhang T， Yang X R， Xu W P， et al. Heat shock protein 90 promotes RNA helicase DDX5 accumulation and exacerbates hepatocellular carcinoma by inhibiting autophagy［J］. Cancer Biology & Medicine， 2021， 18（3）： 693-704.

［9］Daneri-Becerra C， Galigniana M D. The Hsp90-binding immunophilin FKBP52 enhances neurodifferentiation and neuroregeneration in murine models［J］. Neural Regeneration Research， 2022， 17（3）： 555-556.

［10］林智才， 陳燕麗， 蘇小清， 等. Hsp90抑制劑減弱肝癌耐藥細胞株對索拉非尼誘導鐵死亡的耐受性［J］. 現代腫瘤醫學， 2022， 30（21）： 3862-3868.

［11］Rautio J， Kumpulainen H， Heimbach T， et al. Prodrugs： Design and clinical applications［J］. Nature Reviews Drug Discovery， 2008， 7（3）： 255-270.

［12］Diez-Torrubia A， García-Aparicio C， Cabrera S， et al. Application of the dipeptidyl peptidase IV （DPPIV/CD26） based prodrug approach to different amine-containing drugs［J］. Journal of Medicinal Chemistry， 2010， 53（2）： 559-572.

［13］García-Aparicio C， Bonache M C， De Meester I， et al. Design and discovery of a novel dipeptidyl-peptidase IV （CD26）-based prodrug approach［J］. Journal of Medicinal Chemistry， 2006， 49（17）： 5339-5351.

［14］Velzquez S， de Castro S， Diez-Torrubia A， et al. Dipeptidyl-peptidase IV （DPP IV/CD26）-activated prodrugs： A successful strategy for improving water solubility and oral bioavailability［J］. Current Medicinal Chemistry， 2015， 22（8）： 1041-1054.

［15］Brough P A， Aherne W， Barril X， et al. 4，5-diarylisoxazole Hsp90 chaperone inhibitors： Potential therapeutic agents for the treatment of cancer［J］. Journal of Medicinal Chemistry， 2008， 51（2）： 196-218.

［16］Santos C R， Capela R， Pereira C S G P， et al. Structure-activity relationships for dipeptide prodrugs of acyclovir： Implications for prodrug design［J］. European journal of medicinal chemistry， 2009， 44（6）： 2339-2346.

［17］王薇， 薛從建， 陳秋緣， 等. 間苯二酚類熱休克蛋白90抑制劑關鍵中間體5-異丙基-2，4-二甲氧基苯甲醛合成研究［J］. 福建醫科大學學報， 2021， 55（5）： 373-376.

（責任編輯：劉國金）

收稿日期： 2023-01-18網絡出版日期：2023-06-07

作者簡介： 劉文金（1995- ），男，甘肅天水人，碩士研究生，主要從事有機物合成方面的研究。

通信作者： 曹小冬，E-mail： sheldon.cao@eubulusbio.com