告達庭對大鼠肝損傷的改善作用機制研究 Δ

常志惠 ，補陽 ，劉茜 ，馬倩 ，宋捷 ，孫娥 ，韋英杰 ，羅毅 ，譚曉斌 （1.南京中醫藥大學第三臨床醫學院，南京 210028；2.南京中醫藥大學附屬連云港市中醫院藥學部，江蘇 連云港 222002；.中國中醫科學院江蘇分院/江蘇省中醫藥研究院國家中醫藥管理局中藥口服釋藥系統重點研究室，南京 210028； .南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院腫瘤科，南京 210028）

肝臟承擔多種生理機能，其良好的生理狀態是維持機體健康的重要保證。病毒、藥物、代謝異常及環境因素等都容易使肝臟受到損傷[1]。藥物性肝損傷是引發急性肝功能衰竭的主要原因，據估計中國藥物性肝損傷的發病率大約為每10萬人就有23.8例[2]。目前，導致肝損傷的原因多樣且機制復雜，尚缺乏特異性的治療藥物。因此，尋找防治肝損傷的有效藥物迫在眉睫。

內質網內環境穩定是實現內質網功能的基本條件。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERs） 是指細胞受內外因素刺激下，內質網形態與功能的平衡狀態受到破壞，蛋白質加工和運輸受阻，內質網內累積了大量未折疊或錯誤折疊蛋白質[3]。ERs 已成為藥物性肝損傷、肝功能衰竭、病毒性肝炎、胰島素抵抗、脂肪肝、脂肪性肝炎的重要發病機制，對增加肝癌風險具有重要影響[4]。

白首烏為蘿藦科植物大根牛皮消Cynanchum au‐riculatumRoyle ex Wight 的塊根，具有滋補肝腎、強壯身體、養血補血等功效[5―6]。C21甾苷類成分為白首烏的活性成分，具有保肝、抗炎和抗腫瘤等多種生物活性[7―8]，已有研究報道其保肝作用與減輕氧化應激、抑制核因子κB（nuclear factor?κB，NF?κB）信號通路激活有關[5,9]。ERs與氧化應激之間關系密切，ERs可直接促進內質網中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的合成，從而導致肝損傷[10]。告達庭是分離自白首烏的C21甾體苷元（化學結構式見圖1），其是否可通過抑制內質網應激減輕肝損傷尚不明確。基于此，本研究采用二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）誘導肝損傷模型大鼠，探討告達庭對肝損傷的改善作用機制，以期為告達庭的臨床應用提供實驗依據。

圖1 告達庭的化學結構式

1 材料

1.1 主要儀器

7020 型自動生化分析儀購自日立株式會社；Thermo MicroCL21型冷凍離心機購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；Milli?Q 型純水機購自美國 Milli‐pore公司；IX73型倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；PECTERAMAX190型酶標儀購自美國Molecular Devices 公司；PowerPac型通用電泳儀和 Mini?PROTEAN?Tetra cell型垂直電泳轉印系統購自美國Bio?Rad公司；Tanon?5200型化學發光凝膠成像系統購自上海天能科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

告達庭、牛血清白蛋白、DEN、羧甲基纖維素鈉購自美國Sigma公司（批號分別為PHL89596、SRE009、N0258、C9481）；大鼠腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）、白細胞介素6（interleukin?6，IL?6）酶聯免疫吸附試驗（enzyme?linked immunoadsordent assay，ELISA）試劑盒購自美國Biolegend公司（批號分別為438207、437107）；IL?1β ELISA 試劑盒購自美國 R&D Systems 公司（批號RLB00）；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購自美國Med Chem Express公司（批號分別為HY?K0010、HY?K0013 ）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司（批號分別為P0013B、P0010）；ECL化學發光顯色液購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司（批號E412?01/02）；兔源78 kDa葡糖調節蛋白（78?kD glucose?regulated protein，Grp78）單克隆抗體、兔源肌醇需求激酶1α（inositol?requiring en‐zyme?1α，IRE1α）單克隆抗體、兔源蛋白激酶 R 樣內質網激酶（protein kinase R?like ER kinase，PERK）單克隆抗體、兔源NF?κB單克隆抗體、兔源β?肌動蛋白（β?actin）單克隆抗體、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologouspro‐tein，CHOP）單克隆抗體（批號分別為 3177S、3294T、5683T、8242S、93473SF）均購自美國Cell Signaling Tech‐nology公司；兔源磷酸化PERK（p?PERK）單克隆抗體購自美國Abcam公司（批號ab192591）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗購自美國Affinity公司（批號S0001）。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，共24只，體質量為（200±20） g，2月齡，由南京凱斯佳生物科技有限公司提供，動物生產合格證號為SCXK（蘇）2020?0001。所有大鼠均飼養于光/暗各 12 h、室溫（25±2） ℃、相對濕度（60±5）%的SPF級實驗動物中心，自由攝食、飲水。本研究經南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院實驗動物倫理委員會批準，批準編號為AEWC?20200702?119。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

大鼠適應性喂養1周后，隨機分為空白組、模型組和告達庭低、高劑量組（25、50 mg/kg，劑量根據前期的實驗結果設定[4]，臨用時以0.5%羧甲基纖維素鈉溶解）。除空白組外，其余各組大鼠均采用腹腔注射DEN（50 mg/kg）的方法構建大鼠肝損傷模型[11]，每周注射3次，連續8周。于造模第5周開始，大鼠灌胃相應藥物或0.5%羧甲基纖維素鈉，連續4周。大鼠末次給藥后空腹8 h，眼眶取血，血樣室溫靜置 30 min后，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，置于－80 °C冰箱保存備用。取血完成后，處死各組大鼠，并剖取肝臟組織備用。

2.2 大鼠血清中肝功能指標及炎癥因子水平的測定

取各組大鼠血清，采用自動生化分析儀分析血清中肝功能生化指標丙氨酸轉氨酶 （alanine aminotrans?ferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總蛋白（total protein，TP）和總膽紅素（total bilirubin，TBI）水平；采用ELISA 試劑盒測定大鼠血清中炎癥因子IL?6、IL?1β、TNF?α的水平。

2.3 大鼠肝臟組織病理學形態觀察

取大鼠肝臟組織適量，經4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋后，制成4 μm的切片；然后經蘇木素?伊紅（HE）染色后，在光鏡下觀察肝臟組織的病理學變化，并拍照。

2.4 大鼠肝臟組織中NF?κB、Grp78蛋白表達的檢測

采用免疫組化法進行檢測。取大鼠肝臟組織適量，同“2.3”項下方法制備大鼠肝臟石蠟切片，再進行常規脫蠟復水、抗原修復；取出切片，浸泡于3%過氧化氫溶液中，以滅活內源性過氧化物酶；室溫避光孵育10 min，滴加10%山羊血清封閉30 min，滴加Grp78一抗（稀釋度為1∶200）、NF?κB一抗（稀釋度為1∶1 600），4 ℃孵育過夜。次日，于37 ℃條件下孵育相應二抗30 min；以DAB顯色，蘇木素復染細胞核，經乙醇脫水、中性樹膠封片后，于顯微鏡下觀察。每張切片在顯微鏡下隨機選取5個高倍視野，以棕黃色為陽性染色，采用Image?Pro Plus 6.0軟件分析并計算單位測量區域面積內的光密度值，用于評價陽性表達水平。

2.5 大鼠肝臟組織中ERs相關蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取大鼠肝臟組織60 mg，加入適量RIPA裂解液，同時各加入1%的蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑，充分勻漿，冰浴裂解30 min。于4 ℃下以12 000 r/min離心30 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白經變性后，取30 μg進行十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜； 用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1.5 h，分別加入Grp78、CHOP、ATF6、PERK、p?PERK、IRE1α一抗（稀釋度為1∶1 000）和β?actin抗體（稀釋度為1∶5 000），4 ℃孵育過夜；以TBST 溶液洗膜3 次，每次6 min，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋度為1∶5 000），室溫孵育1 h；TBST溶液洗膜3次，每次10 min，滴加ECL發光液，采用化學發光凝膠成像系統采集圖像，并應用Image J軟件分析蛋白灰度值。以Grp78、CHOP、ATF6、IRE1α與內參β?actin的灰度值比值表示其表達水平；以PERK與p?PERK的灰度值比值表示PERK蛋白的磷酸化水平。

2.6 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，數據以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 告達庭對模型大鼠肝功能生化指標的影響

與空白組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST、TBI水平均顯著升高（P＜0.05），血清中TP水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，告達庭各高劑量組大鼠血清中ALT、AST、TBI水平均顯著降低（P＜0.05），TP水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清中肝功能生化指標的檢測結果（±s，n＝6）

表1 各組大鼠血清中肝功能生化指標的檢測結果（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別ALT/（U/L）AST/（U/L）TP/（g/L）TBI/（μmol/L）6.33±0.82 9.83±1.41a 8.25±0.74b 7.95±0.91b空白組模型組告達庭低劑量組告達庭高劑量組10.17±2.40 31.67±3.78a 23.83±2.41b 18.67±2.34b 14.67±3.78 39.50±5.79a 29.50±4.14b 23.17±3.25b 58.17±5.38 51.33±2.73a 57.33±3.67b 58.57±3.39b

3.2 告達庭對模型大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與空白組相比，模型組大鼠血清中IL?6、TNF?α、IL?1β水平均顯著升高（P＜0.05）；模型組相比，告達庭高劑量組大鼠血清中IL?6、TNF?α、IL?1β水平均顯著降低（P＜0.05），告達庭低劑量組大鼠血清中IL?6水平顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清中炎癥因子水平的檢測結果（±s，n＝6，pg/mL）

表2 各組大鼠血清中炎癥因子水平的檢測結果（±s，n＝6，pg/mL）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白組模型組告達庭低劑量組告達庭高劑量組IL?6 22.31±1.31 120.15±2.55a 90.09±1.68 b 78.65±1.83 b TNF?α 12.25±1.43 125.62±16.27a 113.18±18.94 96.49±12.86 b IL?1β 76.32±2.01 590.16±57.33 a 537.92±26.67 465.27±55.74 b

3.3 告達庭對模型大鼠肝臟組織病理學形態的影響

空白組大鼠肝小葉結構完整而清晰，肝細胞索呈放射狀排列，細胞核呈圓形而居中央位，核質均勻分布且著色較深，肝細胞無壞死，無炎癥細胞浸潤。模型組大鼠肝小葉結構紊亂，肝細胞與肝細胞索均排列紊亂，肝細胞腫脹，可見點狀壞死，細胞間分界不明顯，伴隨炎癥細胞浸潤等病理改變，且細胞核多被擠向一側。與模型組相比，告達庭低、高劑量組大鼠肝組織病理學形態呈現出不同程度的改善，肝小葉結構較完整清晰，細胞排列趨整齊，炎癥細胞浸潤也有所減少。結果見圖2。

圖2 各組大鼠肝臟組織病理學形態的顯微圖（HE染色，×400）

3.4 告達庭對模型大鼠肝臟組織中NF?κB、Grp78蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組大鼠肝臟組織中NF?κB、Grp78蛋白陽性表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，告達庭各劑量肝臟組織中NF?κB、Grp7蛋白陽性表達水平顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3、表3。

表3 各組大鼠肝臟組織中NF?κB、Grp78蛋白陽性表達的光密度值測定結果（±s，n＝6）

表3 各組大鼠肝臟組織中NF?κB、Grp78蛋白陽性表達的光密度值測定結果（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白組模型組告達庭低劑量組告達庭高劑量組NF?κB 0.003 9±0.000 7 0.203 4±0.025 1 a 0.138 7±0.017 6 b 0.089 2±0.008 4 b Grp78 0.019 3±0.008 4 0.273 3±0.022 5 a 0.204 6±0.185 7 b 0.126 8±0.150 8 b

圖3 各組大鼠肝臟組織中NF?κB、Grp78蛋白表達的免疫組化圖（×400）

3.5 告達庭對模型大鼠肝臟組織中ERs相關蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組大鼠肝臟組織中Grp78、CHOP、ATF6、IRE1α蛋白表達水平和PERK蛋白磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，告達庭高劑量組大鼠肝臟組織中Grp78、CHOP、ATF6蛋白表達水平和PERK蛋白磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05），低劑量組大鼠肝臟組織中CHOP、ATF6蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖4、表4。

表4 各組大鼠肝臟組織中 Grp78、CHOP、ATF6、IRE1α蛋白表達水平和PERK蛋白磷酸化水平的測定結果（±s，n＝6）

表4 各組大鼠肝臟組織中 Grp78、CHOP、ATF6、IRE1α蛋白表達水平和PERK蛋白磷酸化水平的測定結果（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白組模型組告達庭低劑量組告達庭高劑量組Grp78/β?actin 1.00±0.10 11.71±1.22a 9.85±1.01 7.56±0.78b CHOP/β?actin 1.00±0.15 87.54±9.19 a 69.55±0.62b 58.19±0.60b ATF6/β?actin 1.00±0.12 2.32±0.13 a 1.44±0.10b 1.23±0.09b PERK/p?PERK 1.00±0.08 1.90±0.12 a 1.88±0.12 1.35±0.11b IRE1α/β?actin 1.00±0.14 4.30±0.48 a 3.92±0.36 3.52±0.62

圖4 各組大鼠肝臟組織中ERs相關蛋白表達的電泳圖

4 討論

肝臟不僅是生物轉化、代謝合成及解毒的重要器官，還是藥物代謝及轉化的主要場所，但也是容易受損傷的臟器[12]。白首烏已用于臨床治療肝損傷多年，其中告達庭是其主要活性成分，具有保護肝臟的作用。

DEN是一種N?亞硝基?烷基化合物，口服后可引起嚴重的肝損傷，甚至導致肝癌[13]。因此，本研究采用DEN來誘導肝損傷模型大鼠。ALT、AST、TP和TBI是反映肝功能的重要指標，當肝功能異常時，ALT、AST和TBI的水平升高，而TP則會下降[14]。本研究結果顯示，經告達庭干預后，大鼠血清中ALT、AST、TBI水平降低，TP水平升高，且肝臟組織病理形態改善，炎癥細胞浸潤減少。這表明告達庭對DEN所致大鼠肝損傷具有改善作用。

炎癥反應在DEN所致大鼠肝損傷中起著重要作用。據報道，DEN在導致大鼠肝損傷的同時，也促進大鼠血漿中脂多糖水平升高，從而通過Toll樣受體4/髓樣分化因子88信號通路激活NF?κB，進而促進IL?6、TNF?α和IL?1β的表達[15]。本研究結果顯示，經告達庭干預后，大鼠肝臟組織中NF?κB蛋白陽性表達水平降低，血清中IL?1β、IL?6、TNF?α 水平均降低。這表明告達庭對DEN所致大鼠肝損傷的改善作用與抑制炎癥反應有關。

內質網是碳水化合物代謝、鈣儲存、蛋白質合成和折疊的主要場所，這些過程中的任何不平衡都可能導致ERs，從而通過激活與內質網膜結合的傳感器 PERK、IRE1α 和 ATF6，啟動未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），以恢復內質網功能[16]。CHOP 是 UPR調控的典型的ERs所介導細胞凋亡的關鍵標志物，其表達受 IRE1α、PERK 和 ATF6 這3 條途徑調控[17]。PERK是內質網膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，在非應激狀態時，其主要定位于內質網內腔并與Grp78結合成無活性的復合物；在ERs時，PERK與Grp78解離后發生自身磷酸化，成為活化狀態，從而激活抗氧化應激反應、氨基酸代謝以及細胞凋亡[18]。IRE1α也是一種跨膜蛋白，其活化后可結合并剪切X盒結合蛋白1（X?box?binding protein 1，XBP1），從而上調CHOP表達，進而介導凋亡的發生[19]。ATF6 是內質網膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，在非應激狀態時，其定位于內質網內腔并與Grp78結合；在ERs時，ATF6與Grp78解離后向高爾基復合體轉位，繼而活化ATF6，從而上調UPR相關基因的轉錄和表達[20―21]。本研究結果發現，經告達庭干預后，大鼠肝臟組織中ERs相關蛋白Grp78、CHOP、ATF6表達水平和PERK磷酸化水平均降低。這表明告達庭可通過抑制內質網應激改善大鼠肝損傷。

綜上所述，告達庭對DEN所致大鼠肝損傷具有明顯的改善作用，其作用機制可能與抑制內質網應激和炎癥反應有關。