壯藥三七姜醇提物及含藥血清對脂多糖誘導RAW264.7細胞炎癥的抗炎作用及機制 Δ

梁潔 ，梁晶春 劉星晨 陳曉思 曹玉嬪 陳俊 柳賢福 ，李耀華 朱華 （.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 53000；.廣西高校中藥提取純化與質量分析重點實驗室，南寧 53000；3.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心華南分中心，南寧 53000；.廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院，南寧 530）

三七姜是姜科姜七屬植物姜三七Stahlianthus invo‐lucratus（King ex Bak.） Craib.的塊根和根莖，收錄于《廣西壯族自治區壯藥質量標準》（第二卷），其別名為小田七、竹田七、姜三七等[1]，是廣西民族民間藥，既可用于跌打損傷、風濕骨痛、吐血衄血、月經過多，還能外用治蟲蛇咬傷、外傷出血[2]。本課題組前期研究發現，三七姜醇提物可以明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳郭腫脹、醋酸引起的小鼠毛細血管通透性增加和小鼠棉球肉芽腫增生[3]。進一步研究發現，原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛可能是三七姜發揮抗炎的物質基礎[4]。但其具體抗炎作用機制尚不明確。

Toll樣受體（Toll?like receptors，TLRs）是天然免疫系統中一類保守的模式識別受體，在外界病原體刺激下可激活下游炎癥信號通路[5]。TLR4是TLRs家族中的重要成員，在炎癥反應發生過程中具有重要作用，核因子κB（nuclear factor?κB，NF?κB）作為TLR4信號通路的下游效應因子，在病理條件下，TLR4激活會導致細胞內NF?κB信號轉導并產生炎癥細胞因子而引發炎癥反應[6]。但三七姜是否可通過TLR4/NF?κB信號通路發揮抗炎作用，尚不明確。

三七姜所含化學成分多樣，其口服給藥后，理論上可被吸收入血，進而在人體內循環抵達靶點，當達到一定濃度時可產生相應藥理作用[7]。基于此，本研究先將三七姜灌胃給予大鼠，再取其血清；采用脂多糖（lipo‐polysaccharide，LPS）刺激巨噬細胞RAW264.7，建立體外炎癥細胞模型，進而考察三七姜醇提物和含藥血清對RAW264.7細胞的炎癥因子釋放及TLR4/NF?κB信號通路的影響，初步探索和完善三七姜的抗炎作用機制。

1 材料

1.1 細胞株

小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7購于中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.2 實驗動物

本研究所用動物為SPF級Waster大鼠，雄性（性別對本研究無影響），體質量（200±10） g，購自湖南斯萊克萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2019?0004。大鼠在20～25 ℃的實驗室環境中適應性喂養1周。本動物實驗方案經廣西中醫藥大學倫理委員會批準（批準號為DW20220108?025）。

1.3 主要儀器

本研究所用主要儀器有HR40?ⅡB2型生物安全柜（青島海爾生物科技有限公司），MCO?18AIC型CO2細胞培養箱（日本SAYO公司），DMI3000B型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司），Epoch型全波長酶標儀（美國Bio?Tek公司），1780型紫外分光光度計（日本Shimadzu公司），Sorvall ST 16R型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），LightCycler96型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（瑞士Roche公司），BIO?RADXR型凝膠成像儀、Power Pac Universal型電泳儀（美國Bio?Rad公司）等。

1.4 主要藥品與試劑

三七姜藥材于2020年3月采自廣西南寧武鳴區，經廣西中醫藥大學藥學院滕建北教授鑒定為姜科姜七屬植物姜三七S.involucratus（King ex Bak.） Craib.的塊根和根莖；藥材洗凈后，進行烘干、粉碎處理，然后密封置于干燥陰涼處保存備用。LPS（批號L4391）購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養基（批號C11995500BT）購自美國Gibco公司；胎牛血清（批號04?001?1A）購自美國BI公司；CCK?8試劑盒（批號C0040）購自上海碧云天生物技術有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）、白細胞介素 6（inter‐leukin?6，IL?6）、IL?1β酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（批號分別為210308N3、210308T2、210308I2、210308I6）購自江蘇晶美生物科技有限公司；RIPA裂解液（批號R0020）購自北京索來寶科技有限公司；兔源環氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX2）多克隆抗體（批號BS10411R）購自北京博奧森生物技術有限公司；兔源一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）多克隆抗體（批號 AF0199）、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號AF7018）購自北京維百奧生物科技有限公司；ECL發光試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗免疫球蛋白G二抗（批號分別為sc?2048、ZB2301）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；其余試劑為實驗室常用規格。

2 方法

2.1 三七姜醇提物的制備

取三七姜藥材適量置于烘箱內烘干后粉碎成粗粉，加入8倍量的80%乙醇溶液加熱回流提取3次，每次2 h；過濾，合并濾液，60 ℃減壓回收乙醇至藥液無醇味，水浴加熱濃縮得三七姜醇提物浸膏，備用。取浸膏0.15 g，精密稱定，加入0.1%的二甲基亞砜超聲（頻率50 kHz，功率250 W）溶解，再用DMEM不完全培養基稀釋至3 mg/mL，過無菌濾膜，再用完全培養基稀釋至所需濃度，現用現配。

2.2 三七姜醇提物大鼠含藥血清的制備

取12只大鼠隨機分為空白組和三七姜醇提物組，每組各6只。三七姜醇提物組大鼠按75.35 g/kg（按生藥量計算）灌胃（劑量相當于成人臨床等效劑量的50倍），空白組大鼠灌胃等體積純凈水，每天灌胃2次，連續給藥3 d。第3天灌胃后0.5、1、1.5 h（給藥前禁食不禁水12 h），末次給藥1 h后用戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，室溫靜置2 h后，以3 000 r/min離心10 min；無菌分離血清，將3個時間點的血清等比例混合，以0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，56 ℃滅活30 min，分裝，置于－80 ℃保存。使用時，以DMEM不完全培養基稀釋至所需濃度。

2.3 細胞培養

將RAW264.7細胞采用完全培養基[10% 胎牛血清（FBS）+1%雙抗+89% DMEM不完全培養基]在37℃含5% CO2的培養箱中培養。

2.4 細胞分組、造模與培養

將RAW264.7細胞按5 000個/孔接種于96孔板中，當其融合度達80%時，分為正常對照組（DMEM培養基+RAW264.7細胞，不作任何處理，培養24 h），LPS組[DMEM培養基+RAW264.7細胞+LPS（終濃度為1 μg/mL，下同），培養24 h]，三七姜醇提物高、中、低劑量組[DMEM培養基+RAW264.7細胞+高、中、低劑量三七姜醇提物（終濃度分別為50、25、12.5 μg/mL，濃度設置參考預實驗結果），孵育2 h，然后加入LPS，培養24 h]，4%或15%空白血清組[DMEM培養基+RAW264.7細胞+空白對照組大鼠血清（4%或15%，濃度設置參考預實驗結果），培養24 h]，4%或15%空白血清+LPS組[DMEM培養基+RAW264.7細胞+空白對照組大鼠血清（4%或15%），孵育2 h，然后加入LPS培養24 h]，4%或15%含藥血清組[DMEM培養基+RAW264.7細胞+三七姜醇提物組大鼠含藥血清（4%或15%），培養24 h]，4%或15%含藥血清+LPS組[DMEM培養基+RAW264.7細胞+三七姜醇提物大鼠組含藥血清（4%或15%），孵育2 h，然后加入LPS培養24 h]。

2.5 細胞活力的檢測

采用CCK?8法進行檢測。取對數生長期的RAW264.7細胞，按“2.4”項下方法分組、造模、給藥與培養，每組設3個復孔。培養結束后，每孔加入CCK?8溶液10 μL，混勻后孵育2 h，采用酶標儀于450 nm波長處測定各孔吸光度（absorbance，A）值，并計算細胞存活率（細胞存活率＝A給藥孔/A對照孔×100%）。

2.6 細胞中NO、TNF?α、IL?1β、IL?6含量的檢測

采用ELISA法進行檢測。取對數生長期的RAW264.7細胞，按“2.4”項下方法分組、造模、給藥與培養，每組設3個復孔。培養結束后，收集細胞培養液，在室溫條件下1 200 r/min離心10 min，取上清液，根據相應試劑盒說明書方法進行操作，測定各孔A值，并計算NO、TNF?α、IL?1β、IL?6含量。

2.7 細胞中TLR4、NF?κB mRNA表達水平的檢測

采用RT?PCR法進行檢測。取對數生長期的RAW264.7細胞，按“2.4”項下方法分組、造模、給藥與培養，每組設3個復孔。培養結束后，采用Trizol試劑提取細胞總RNA，利用逆轉錄試劑盒制備cDNA，以cDNA為模板進行PCR。PCR反應體系（共20 μL）為Go‐Taq?qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 1.5 μL，Nuclease?Free Water 7.5 μL。反應條件為95 ℃熱變性120 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸 30 s，循環40次。以GAPDH為內參，采用2－ΔΔCt法分析目的基因的表達水平。PCR引物序列及擴增產物長度見表1。

表1 PCR引物序列及擴增產物長度

2.8 細胞中NOS、COX?2蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取對數生長期的RAW264.7細胞，按“2.4”項下方法分組、造模、給藥與培養，每組設3個復孔。培養結束后，收集細胞，加入300 μL RIPA裂解液，充分混勻，裂解2 h；再以12 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA試劑盒測定上清液中的蛋白濃度，然后將蛋白進行變性處理，經十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉至PVDF膜上；以5%脫脂牛奶封閉1 h，加入GAPDH（稀釋度為1∶2 000）、COX?2（稀釋度為1∶800）、NOS（稀釋度為1∶800）一抗，4 ℃孵育過夜；以PBST洗膜2次，加入相應二抗（稀釋度為1∶3 000）室溫下孵育1～2 h；以PBST洗膜3次，加入ECL顯色，采用凝膠成像發光系統顯影曝光。采用Image J 1.8.0軟件進行圖像灰度值分析，以目的蛋白與內參（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.9 統計學分析

采用GraphpadPrism 8.3軟件進行分析處理，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD?t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 三七姜醇提物及含藥血清對RAW264.7細胞活力的影響

各組RAW264.7細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05）。由此可見，1 μg/mL的LPS，低、中、高劑量的三七姜醇提物，4%、15%的含藥血清及空白血清均未對細胞生長活力造成影響，因此，所選藥物濃度可用于后續實驗。結果見圖1。

圖1 各組RAW264.7細胞活力的檢測結果（±s，n＝3）

3.2 三七姜醇提物及含藥血清對RAW264.7細胞中NO、TNF?α、IL?1β、IL?6含量的影響

與正常對照組比較，LPS組RAW264.7細胞中NO、TNF?α、IL?1β 和 IL?6的含量顯著升高（P＜0.05）。與LPS組比較，三七姜醇提物各劑量組RAW264.7細胞中上述指標含量均顯著降低（P＜0.05）。與4%或15%空白血清組比較，4%或15%空白血清+LPS組RAW264.7細胞中上述指標含量均顯著升高（P＜0.05）。與4%或15%空白血清+LPS組比較，4%或15%含藥血清+LPS組細胞中上述指標含量均顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組RAW264.7細胞中NO、TNF?α、IL?1β和IL?6含量的測定結果（±s，n＝3）

表2 各組RAW264.7細胞中NO、TNF?α、IL?1β和IL?6含量的測定結果（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與LPS組比較，P＜0.05；c：與4%空白血清組比較，P＜0.05；d：與15%空白血清組比較，P＜0.05；e：與4%空白血清+LPS組比較，P＜0.05；f：與15%空白血清+LPS組比較，P＜0.05

組別正常對照組LPS組三七姜醇提物高劑量組三七姜醇提物中劑量組三七姜醇提物低劑量組4%空白血清組15%空白血清組4%空白血清+LPS組15%空白血清+LPS組4%含藥血清組15%含藥血清組4%含藥血清+LPS組15%含藥血清+LPS組NO/（μmol/L）12.44±0.33 39.52±2.03a 22.10±2.10b 23.71±1.28b 25.36±0.88b 9.68±1.40 10.57±1.72 17.23±1.59c 17.69±1.37d 10.47±2.54 11.40±2.36 12.49±1.25e 12.79±1.89f TNF?α/（pg/mL）155.47±12.28 430.27±19.72a 333.77±12.95b 295.77±8.75b 297.50±13.71b 112.82±4.73 108.26±9.20 240.83±13.31c 235.57±12.46d 102.04±3.95 113.21±5.52 110.40±13.29e 123.30±4.43f IL?1β/（pg/mL）27.08±3.20 102.54±3.27a 53.09±4.33b 62.63±3.08b 68.62±2.22b 18.91±2.91 16.12±3.63 58.22±3.55c 50.71±4.02d 14.51±2.27 13.09±2.82 39.80±4.36e 30.33±3.20f IL?6/（pg/mL）24.03±3.17 81.64±3.20a 52.69±3.52b 59.38±2.46b 67.75±4.76b 16.40±3.46 17.25±1.88 40.18±4.23c 31.22±3.85d 13.40±2.93 11.46±2.91 26.83±3.67e 19.37±3.83f

3.3 三七姜醇提物及含藥血清對RAW264.7細胞TLR4、NF?κB mRNA表達的影響

與正常對照組比較，LPS組RAW264.7細胞中TLR4、NF?κB mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與LPS組比較，三七姜醇提物各劑量組細胞中TLR4、NF?κB mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.05）。與4%或15%空白血清組比較，4%或15%空白血清+LPS組RAW264.7細胞中TLR4、NF?κB mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與4%或15%空白血清+LPS組比較，4%或15%含藥血清+LPS組細胞中TLR4、NF?κB mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組RAW264.7細胞中TLR4、NF?κB mRNA表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

表3 各組RAW264.7細胞中TLR4、NF?κB mRNA表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與LPS組比較，P＜0.05；c：與4%空白血清組比較，P＜0.05；d：與15%空白血清組比較，P＜0.05；e：與4%空白血清+LPS組比較，P＜0.05；f：與15%空白血清+LPS組比較，P＜0.05

組別正常對照組LPS組三七姜醇提物高劑量組三七姜醇提物中劑量組三七姜醇提物低劑量組4%空白血清組15%空白血清組4%空白血清+LPS組15%空白血清+LPS組4%含藥血清組15%含藥血清組4%含藥血清+LPS組15%含藥血清+LPS組TLR4 mRNA 1.00±0.06 3.28±0.16a 2.09±0.11b 1.97±0.13b 2.53±0.09b 1.25±0.14 1.20±0.08 1.84±0.03c 1.86±0.04d 1.06±0.11 1.60±0.12 1.12±0.09e 1.18±0.13f NF?κB mRNA 1.04±0.06 4.04±0.26a 2.53±0.09b 1.97±0.13b 2.09±0.11b 1.78±0.09 1.72±0.06 2.21±0.05c 2.19±0.06d 1.47±0.05 1.75±0.22 1.53±0.12e 1.46±0.13f

3.4 三七姜醇提物及含藥血清對RAW264.7細胞中NOS、COX?2蛋白表達的影響

與正常對照組比較，LPS組細胞中NOS、COX?2蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，三七姜醇提物各劑量組細胞中NOS、COX?2蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。與4%或15%空白血清組比較，4%或15%空白血清+LPS組RAW264.7細胞中NOS、COX?2蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與4%或15%空白血清+LPS組比較，4%或15%含藥血清+LPS組細胞中NOS、COX?2蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖2、表4。

表4 各組RAW264.7細胞中NOS、COX?2蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

表4 各組RAW264.7細胞中NOS、COX?2蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與LPS組比較，P＜0.05；c：與4%空白血清組比較，P＜0.05；d：與15%空白血清組比較，P＜0.05；e：與4%空白血清+LPS組比較，P＜0.05；f：與15%空白血清+LPS組比較，P＜0.05

分組正常對照組LPS組三七姜醇提物高劑量組三七姜醇提物中劑量組三七姜醇提物低劑量組4%空白血清組15%空白血清組4%空白血清+LPS組15%空白血清+LPS組4%含藥血清組15%含藥血清組4%含藥血清+LPS組15%含藥血清+LPS組NOS 0.476 4±0.024 7 1.579 8±0.036 9a 0.792 9±0.028 2b 0.923 5±0.045 4b 1.214 9±0.035 9b 0.369 0±0.012 3 0.458 8±0.027 2 0.952 6±0.034 1c 1.071 5±0.039 7d 0.659 1±0.031 8 0.812 0±0.026 3 0.340 6±0.015 3e 0.329 5±0.035 7f COX?2 0.345 5±0.016 7 1.614 3±0.042 1a 1.040 3±0.055 3b 1.202 2±0.025 2b 1.291 1±0.042 6b 0.420 4±0.046 9 0.179 6±0.027 2 0.912 9±0.034 7c 0.796 9±0.039 6d 0.427 1±0.015 3 0.540 7±0.026 9 0.670 3±0.044 1e 0.591 9±0.038 8f

圖2 各組RAW264.7細胞中COX?2、NOS蛋白表達的電泳圖

4 討論

炎癥反應是宿主在內外因素刺激之下產生的一種防御性反應，受多種信號通路調控[8]。革蘭氏陰性桿菌的組成成分LPS為重要的炎癥反應觸發劑，可誘導多種細胞因子引發炎癥反應[9]。巨噬細胞通過其細胞膜表面表達的TLR4受體識別LPS，進而激活下游信號通路（如NF?κB、絲裂原活化蛋白激酶）[10]。隨后，活化的炎癥相關信號可誘導一系列促炎癥因子的轉錄、翻譯，包括NOS、COX?2、TNF?α、IL?1β、IL?6等[11]，從而參與炎癥性疾病的發生與發展。

RAW264.7細胞作為機體內非常重要的免疫細胞和炎癥效應細胞，在誘導炎癥反應的過程中起著關鍵作用，其能夠在LPS的刺激下釋放各種炎癥因子，如NO、TNF?α、IL?1β、IL?6等[12]，這些炎癥因子的含量增加是判斷炎癥是否發生的重要指標。NO廣泛存在于各種生物體內，機體內適量的NO可在炎癥初期快速地清除病原體以緩解炎癥反應，但當NO濃度過高時，可導致局部機體組織損傷，從而加重炎癥反應[13]。NOS和COX?2是兩種誘生型酶，NOS主要在細胞損傷后表達水平上升，從而合成大量NO，進而導致細胞損傷[14]；COX?2是一種誘導型環氧化酶，其在正常機體細胞中表達量很低，但在經LPS刺激的巨噬細胞中表達水平會迅速上升，從而介導炎癥介質前列腺素的產生[15]。本研究結果顯示，三七姜含藥血清和醇提物均可抑制RAW264.7細胞中炎癥因子的釋放，下調COX?2、NOS蛋白的表達，這說明三七姜含藥血清和醇提物均能通過降低凋亡蛋白和炎癥因子表達來改善LPS誘導的細胞炎癥，并減輕其炎癥損傷，且含藥血清的百分比越大，抗炎作用越明顯。但整體而言，三七姜醇提物的抗炎效用不及含藥血清，這可能是因為含藥血清經過體內的代謝、轉化，產生了其他具有抗炎作用的物質。

NF?κB是炎癥反應過程中重要的基因轉錄調控因子[16]，其家族成員主要包括p65和p50。一般情況下，NF?κB（p50/p65）以二聚體形式存在；在炎癥刺激條件下，NF?κB信號通路被激活，NF?κB?p65由細胞質移位至細胞核，進而促進TNF?α、IL?6、IL?1β、NOS等炎癥因子的釋放[17―18]。NF?κB信號通路活化的標志是p65亞基的磷酸化與核轉位[19]。因此，抑制NF?κB的磷酸化水平和核轉位是抑制炎癥反應的關鍵。TLR4廣泛存在于巨噬細胞、平滑肌細胞等細胞表面，其可以通過NF?κB信號轉導，促使炎癥因子釋放，進而介導炎癥反應[20]。本研究結果顯示，經三七姜醇提物和含藥血清干預后，RAW264.7細胞中TLR4、NF?κB mRNA表達水平均降低。這說明三七姜醇提物和含藥血清對RAW264.7細胞的抗炎作用可能與抑制TLR4/NF?κB信號通路活性相關。

綜上所述，三七姜醇提物及含藥血清均可明顯減輕LPS誘導的細胞炎癥反應，其抗炎機制可能與抑制TLR4/NF?κB信號通路活性，下調COX?2、NOS蛋白表達，減少炎癥因子釋放有關。