一葉萩藥材質量控制方法研究Δ

張靜，孟靈旭，張洪濤，朱正華，孟相俊，張嘯環 （長春中醫藥大學藥學院，長春 130117）

一葉萩為大戟科白飯樹屬植物一葉萩Flueggea suf‐fruticosa（Pall.） Baill.的干燥葉或帶花葉的嫩枝，為我國民間常用草藥，分布廣泛，藥用資源豐富。該藥具有祛風活血、益腎強筋的功能，常用于治療風濕腰痛、四肢麻木、陽痿、小兒疳積、面神經麻痹、小兒麻痹癥后遺癥等[1―2]?，F代藥理學研究表明，一葉萩可以作用于中樞神經系統，并具有抗腫瘤、抗病毒以及治療再生障礙性貧血等多種藥理作用[3]。

目前一葉萩被收載于1986年版《吉林省中藥炮制標準》和1986年版《浙江省中藥炮制規范》。以上標準形成較早，只記載了一葉萩的名稱、來源及性狀描述，沒有質量控制項目，已不適應目前對中藥質量控制的相關要求。一葉萩主要含有生物堿類、黃酮及其苷類、巖白菜素類、酚酸類及鞣質等多種化學成分[4]。其中一葉萩型生物堿類化合物為其主要化學成分，其主要單體成分為一葉萩堿。一葉萩堿主要作用于中樞神經，能增加大腦、脊髓、肝、腎、骨骼肌的耗氧量[5―6]，具有中樞神經系統興奮活性，該活性與一葉萩可治療小兒麻痹后遺癥及神經麻痹等作用相關[7]。蘆丁和槲皮素是黃酮類代表成分，可用于防治高血壓及作為動脈硬化的輔助治療劑，具有抗氧化、抗炎等作用[3]?；诖?，本研究對一葉萩藥材進行了顯微鑒別，水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物測定，采用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法定性鑒別了藥材中的一葉萩堿、蘆丁和槲皮素，并采用高效液相色譜（high pressure chromatography，HPLC）法測定了一葉萩堿的含量，旨在為完善該藥材的質量標準提供參考依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有LC?2030型HPLC儀（日本Shimadzu公司）、CX43型生物顯微鏡（日本Olympus公司）、AB2665S型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Q?250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥材與試劑

一葉萩堿對照品（批號R04J9F6290）、蘆丁對照品（批號M09HB177693）、槲皮素對照品（批號100081?201610）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%；硅膠G薄層板購自青島海洋化工有限公司；三乙胺、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。16批一葉萩藥材樣品均采集于吉林?。ū?），經長春中醫藥大學藥學院翁麗麗教授鑒定均為大戟科白飯樹屬植物一葉萩F.suffruticosa（Pall.） Baill的干燥葉或帶花葉的嫩枝。將藥材晾干后粉碎，過二號和三號篩，備用。其中，批號為2021060807（編號YYQ?7）的一葉萩藥材（帶花葉嫩枝）經基原鑒定、干燥后作為對照藥材。

表1 16批一葉萩藥材樣品信息

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

一葉萩藥材粉末（過五號篩）呈灰綠色，葉表皮細胞呈多角形、類方形及長方形；氣孔為不定式，副衛細胞4～7個；草酸鈣簇晶直徑5～20 μm，常排列成行；導管為螺紋、環紋、網紋和具緣紋孔導管，直徑5～40 μm。帶花葉嫩枝的花粉粒呈類球形，直徑約15 μm，有3個萌發孔；纖維多成束，直徑約10 μm；木薄壁細胞呈類方形或長方形，壁木化增厚。一葉萩藥材的顯微鑒別圖見圖1。

圖1 一葉萩藥材的顯微鑒別圖（編號YYQ?7）

2.2 TLC鑒別

2.2.1 一葉萩堿的TLC鑒別 參考文獻[8―9]，取16批一葉萩藥材粉末（過二號篩）各1 g，加濃氨水10 mL浸泡1 h，加三氯甲烷20 mL，靜置3 h，超聲（功率150 W，頻率40 kHz，下同）30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。再取一葉萩對照藥材適量，同法制得對照藥材溶液。另取一葉萩堿對照品適量，加無水乙醇配制成質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》（四部）中的TLC法[10]，取上述供試品溶液、對照藥材溶液和一葉萩堿對照品溶液各4 μL，點于同一硅膠G薄層板上，用三氯甲烷?石油醚?乙醇（9∶9∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，用改良的碘化鉍鉀溶液噴霧顯色。結果顯示，供試品溶液色譜在與對照藥材及一葉萩堿對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。一葉萩堿的TLC鑒別圖見圖2。

圖2 一葉萩堿的TLC鑒別圖

2.2.2 蘆丁的TLC鑒別 參考文獻[11]，取16批一葉萩藥材粉末（過二號篩）各2 g，置具塞錐形瓶中，加入20 mL石油醚后靜置1 h，過濾，收集濾渣，加60%甲醇溶液30 mL，超聲30 min，過濾，即得供試品溶液。再取一葉萩對照藥材適量，同法制得對照藥材溶液。另取蘆丁對照品適量，加甲醇制成質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》（四部）中的TLC法[10]，取上述供試品溶液、對照藥材溶液和蘆丁對照品溶液各2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯?甲酸?水（8∶1∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，在365 nm波長紫外燈下觀察。結果顯示，供試品溶液色譜在與對照藥材及蘆丁對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。蘆丁的TLC鑒別圖見圖3。

圖3 蘆丁的TLC鑒別圖

2.2.3 槲皮素的TLC鑒別 參考文獻[12]，取16批一葉萩藥材粉末（過二號篩）各1 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇?25%鹽酸（4∶1，V/V）溶液15 mL，超聲提取60 min，過濾，即得供試品溶液。再取一葉萩對照藥材適量，同法制得對照藥材溶液。另取槲皮素對照品適量，加甲醇制成質量濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》（四部）中的TLC法[10]，取上述供試品溶液、對照藥材溶液和槲皮素對照品溶液各2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯?甲酸?甲苯（2∶1∶5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在365 nm波長紫外燈下觀察。結果顯示，供試品溶液色譜在與對照藥材及槲皮素對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。槲皮素的TLC鑒別圖見圖4。

圖4 槲皮素的TLC鑒別圖

2.3 水分、總灰分及酸不溶性灰分的測定

按照2020年版《中國藥典》（四部）“通則0832”項下“烘干法”和“通則2302”項下方法測定一葉萩藥材樣品中的水分、總灰分及酸不溶性灰分[10]。結果顯示，16批一葉萩藥材樣品中的水分質量分數為7.65%～10.35%，平均值為9.26%；總灰分質量分數為5.67%～8.29%，平均值為6.96%；酸不溶性灰分質量分數為0.61%～1.98%，平均值為1.17%。以平均值上浮20%為大致標準，初步擬定一葉萩藥材中的水分不得過12.0%，總灰分不得過9.0%，酸不溶性灰分不得過2.0%。

2.4 浸出物測定

取一葉萩藥材樣品粉末（過二號篩），用70%乙醇作為提取溶劑，按照2020年版《中國藥典》（四部）“通則2201”項下“熱浸法”進行測定[10]。結果顯示，16批一葉萩藥材樣品中醇溶性浸出物的質量分數在22.77%～37.24%之間，平均值為28.89%。以平均值下調20%為大致標準，初步擬定一葉萩藥材中醇溶性浸出物不得少于20.0%。

2.5 一葉萩堿的含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈?0.01%三乙胺（30∶70，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為255 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。在此色譜條件下，供試品溶液中一葉萩堿的分離度良好，不受其他成分干擾。HPLC圖見圖5。

圖5 一葉萩堿含量測定的HPLC圖

2.5.2 對照品溶液的制備 取一葉萩堿對照品適量，精密稱定，加無水乙醇充分溶解，配制成質量濃度為26.2 μg/mL的對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 參考文獻[13]，取一葉萩藥材粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入氨水1 mL，再精密加入三氯甲烷50 mL，密塞，稱定質量，靜置12 h，超聲30 min，再稱定質量，用三氯甲烷補足減失的質量，濾過；精密量取續濾液10 mL，置蒸發皿中蒸干，殘渣加無水乙醇溶解并轉移至25 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，進樣前過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5.4 線性關系考察 精密吸取“2.5.2”項下對照品溶液2、4、6、8、12、16、20 μL，注入HPLC儀中，按“2.5.1”項下色譜條件測定峰面積。以峰面積為縱坐標（Y）、進樣量為橫坐標（X）進行線性回歸，得回歸方程為Y＝4.000 0×106X－7.959 2×103（R2＝0.999 8）。結果顯示，一葉萩堿的進樣量在0.052 4～0.524 0 μg范圍內與峰面積成良好的線性關系。

2.5.5 重復性試驗 取同批一葉萩藥材樣品（編號YYQ?7）6份，每份約1 g，精密稱定，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，以外標法計算樣品中一葉萩堿的含量。結果顯示，一葉萩堿的平均含量為3.017 mg/g，RSD為2.13%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.5.6 精密度試驗 精密吸取一葉萩堿對照品溶液10 μL，按“2.5.1”項下色譜條件重復進樣測定6次，計算峰面積。結果顯示，峰面積的RSD為0.50%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5.7 穩定性試驗 取一葉萩藥材樣品（編號YYQ?7）1 g，精密稱定，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件在制備后0、4、6、8、10、12、24 h分別進樣測定，計算峰面積。結果顯示，峰面積的RSD為0.98%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗 取15.13 mg一葉萩堿對照品，置于500 mL容量瓶中，加三氯甲烷溶解并定容，即得質量濃度為0.030 26 mg/mL的對照品溶液。取一葉萩藥材樣品（編號YYQ?7）6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入上述對照品溶液（質量濃度為0.030 26 mg/mL）50 mL，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表2。由表2可知，一葉萩堿的平均加樣回收率為97.47%，RSD為1.63%（n＝6），表明該方法準確度良好。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.5.9 樣品含量測定 取16批一葉萩藥材樣品粉末（過三號篩），每份約1 g，精密稱定，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，以外標法計算樣品中一葉萩堿的含量，每批樣品平行測定3次，取平均值，結果見表3。由表3可知，16批樣品中一葉萩堿的含量在1.003～6.872 mg/g之間。考慮到質量標準制定的適用性和藥材來源的差異性，本研究以略低于一葉萩堿含量最低值設限，初步擬定本品中一葉萩堿含量不得低于1.00 mg/g。

表3 16批一葉萩藥材樣品中一葉萩堿的含量測定結果（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 TLC鑒別條件的選擇

在一葉萩堿的TLC鑒別中，筆者前期考察了靜置時間（1、2、3 h）、點樣量（2、3、4 μL）對鑒別結果的影響，結果顯示當樣品靜置3 h、點樣量為4 μL時，所得色譜圖分離度較好、比移值（Rf值）適宜、斑點清晰。在蘆丁的TLC鑒別中，筆者前期考察了不同提取溶劑（60%乙醇、60%甲醇）對鑒別結果的影響，結果顯示以60%甲醇超聲提取樣品，所得色譜圖分離度較好、Rf值適宜。在槲皮素的TLC鑒別中，筆者前期以乙酸乙酯?甲苯?甲酸?水（17∶0.8∶2∶2，V/V/V/V）作為展開劑，結果顯示色譜圖具有嚴重拖尾現象，且Rf值較大；后將展開劑改為乙酸乙酯?甲酸?甲苯（2∶1∶5，V/V/V），所得色譜圖斑點清晰、分離度較好、Rf值適宜。此外，筆者還考察了樣品在不同溫度、不同濕度、不同廠家薄層板下的展開效果，發現與本研究上述結果并無明顯差別，表明該方法耐用性較好。

3.2 浸出物測定方法和浸出溶劑體積分數的確定

一葉萩中的主要化學成分為生物堿類、黃酮類、酚酸類以及微量元素，大部分是醇溶性成分。以有效成分溶出度高、雜質溶出度低為原則，本研究按照2020年版《中國藥典》（四部）“通則2201”浸出物測定法[10]，考察了不同浸出方法（冷浸法、熱浸法）和不同體積分數浸出溶劑（50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）的浸出物測定結果。結果表明，采用熱浸法測出的浸出物質量分數較高；隨著乙醇體積分數的增加，浸出物質量分數逐漸降低，雖然采用50%乙醇和60%乙醇作為浸出溶劑時的浸出物質量分數較高，但過濾時間較長、操作困難，影響了結果的準確性，故經綜合考慮，最終選用70%乙醇作為浸出溶劑。

3.3 定量檢測

3.3.1 HPLC條件的選擇 取一葉萩堿對照品溶液，用紫外分光光度計進行全波長掃描，結果顯示其在255 nm波長處有較強吸收，基線較平穩，分離度較好，且測定不受雜質干擾，故本研究最終選擇255 nm作為檢測波長。同時，本研究前期考察了不同流動相（乙腈?水、乙腈?0.1%磷酸、乙腈?0.01%三乙胺）及不同流動相比例（40∶60、30∶70、20∶80，V/V）對色譜峰峰形的影響，結果發現采用乙腈?0.01%三乙胺（30∶70，V/V）作為流動相，一葉萩堿色譜峰的峰形對稱、分離度較好，且能夠防止拖尾[14]。此外，本研究還對不同柱溫（25、30、35 ℃）、不同色譜柱（Waters XBridge C18、Agilent TC?C18、Hypersil ODS C18）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）進行了考察，結果顯示采用文中色譜條件，所得結果更穩定可靠。

3.3.2 供試品溶液制備條件的選擇 本研究分別考察了不同氨水加入量（0.5、1、2 mL）、不同溶劑量（25、50、100 mL）、不同靜置時間（0、12 h）、不同超聲提取時間（20、30、40 min）對一葉萩藥材樣品中一葉萩堿含量的影響。結果顯示，供試品溶液的最佳制備方法是加入1 mL氨水，精密加入50 mL三氯甲烷，靜置12 h，超聲提取30 min。

綜上所述，本研究對一葉萩藥材進行了顯微、TLC鑒別，水分、總灰分及酸不溶性灰分、醇溶性浸出物測定，對藥材中主要化學成分一葉萩堿的含量進行了測定，并初步擬定了各指標的限度標準，可為該藥材的質量控制和質量標準制定提供依據，有利于推動一葉萩藥材資源的開發和利用。