一種細胞固定和密度估算及塑形一體化裝置設計

田野，劉肖（通信作者），于超，楊潤，劉路錄，張志勇

1 解放軍總醫院海南醫院 （海南三亞 572013）；2 解放軍聯勤保障部隊第九六〇醫院（山東濟南 250012）；3 解放軍總醫院海南醫院 （海南三亞 572013）

人體器官上皮因自然更新所脫落的細胞，被稱為脫落細胞。臨床常見的含有脫落細胞的樣本主要包括：尿液、痰液、乳汁、精液等自然排出液，胸水、腹水、心包積液、腦脊液、卵巢囊腫液等體腔抽出液，以及宮頸、口腔等體腔搔刮細胞。脫落細胞樣本能夠為多種疾病的診斷提供重要參考依據[1-2]，且具有取樣簡便、可多次重復、對患者損傷小、患者依從性高的優勢。

涂片、推/拉片、滴片等是目前最常用的脫落細胞制片方法[3]，此類方法無需使用特殊的儀器設備，通常先將脫落細胞樣本進行固定和離心濃縮，然后將濃縮液滴在載玻片上，再分別通過涂抹、推拉或自然沉降的方法，使細胞在載玻片表面形成薄層，風干后洗滌染色；此類方法靠肉眼預估細胞密度，制片往往出現細胞疊加堆積，導致鏡下觀察困難，易發生漏診、誤診[3]。薄層液基制片技術（thin-cytologic test，TCT），制片效果好且可實現全自動化，目前多被應用于宮頸脫落細胞樣本[4]；但是該方法制得的細胞制片較易脫片，無法耐受常規的高溫抗原修復步驟，因此病理科在進行免疫細胞化學（immunocytochemistry，ICC）染色檢測時，通常需要先制作細胞蠟塊再行切片染色[5]，同時該方法需要采用特定儀器和耗材，除宮頸細胞外，其他類型樣本由于處理步驟繁復且成本較高，臨床應用較為受限。

制作細胞蠟塊，通常要先對脫落細胞樣本進行逐級離心濃縮，然后離心沉降，再將細胞團塊從離心管中取出[6]，但該方法取出的細胞團塊大小不一，易破碎丟失細胞。因此也有在細胞濃縮懸液中加入瓊脂、血漿凝固酶等使細胞凝結為團塊[7]，再進行石蠟包埋，但加入此類凝固劑后可能導致ICC 染色背景加深或出現污染。此外，上述方法均僅憑肉眼觀察和以往工作經驗評估細胞密度，缺乏客觀性。由此可見，以上細胞制片方法均存在一定局限。

基于上述情況，如何進一步提高脫落細胞制片技術方法的標準化程度、效率，是技術工作者所面對的重要問題。為此，本研究旨在開發一種可快速進行脫落細胞樣本固定、細胞密度估算和細胞團塊制作的裝置，并對以該裝置制作的細胞蠟塊石蠟切片的蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和ICC 染色效果進行觀察和評估，從而明確該裝置的臨床應用價值，為開發新的脫落細胞樣本制片技術提供實驗依據。

1 設計

1.1 樣本采集和保存

本研究樣本為：經病理檢測后剩余的胸、腹水各6 例，共計12 例樣本以細胞保存液（安必平，粵穗械備20140065 號）固定，樣本和保存液的體積比為5‥1。采用細胞計數板（Watson，177-112C）計數細胞懸液密度后，將樣本置于50 ml 透明離心管中4 ℃保存，1 個月內完成所有檢測。

1.2 細胞離心管的設計、制作和驗證

本裝置由細胞離心管和密度標簽組成。其中，離心管包括管體和上、下管蓋（圖1 A）。管體外徑為28 mm，總高為 125 mm，與常見的50 ml 離心管外尺寸基本一致，適用于市面上常見的50 ml 離心機轉子，容積大于50 ml；下管口內徑為4 mm，高度為10 mm；管壁厚度為2 mm，斜坡及下口處增加至3 mm，以確保其機械硬度。上、下口及管蓋均為螺紋口設計；此外，在下管蓋內還增加了厚度為1.5 mm的橡膠密封墊片，以進一步增強下口密封性。

目前，可用于三維立體（3 dimensions，3D）打印的材料很多[8]，其中丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（acrylonitrile butadiene styrene，ABS）是一種常用的熱塑性樹脂材料，具有強度高、韌性好、易于加工成型，具加工產品表面光潔，機械性能良好[9]。因此，我們使用了ABS 作為本裝置離心管的3D 打印材料，并打印了成品模型（圖1 B）。

圖1 細胞離心管

由于3D 打印建模的設計尺寸與成品尺寸存在一定偏差，尤其是螺紋等精密部件[10]，因此，為進一步測試其剛性和密閉性，我們在3D 打印模型中加入50 ml 蒸餾水，擰緊管蓋后，2 000 ×g，離心15 min，以管體、管蓋無變形同時無漏液為符合性能要求的標準，否則修改建模設計參數，以補償誤差值，重新打印模型。

1.3 密度標簽的設計、制作和驗證

密度標簽由兩個不同灰度值的矩形和兩條平行橫線組成（圖2）。左側矩形三原色（red green blue，RGB）值為75、75、75；右側矩形RGB 值為200、200、200；兩個矩形大小均為7.5 mm×10 mm，橫線長15 mm，間距為2 mm，RGB 值為0、0、0。

圖2 密度標簽

12 例已固定的胸/腹水樣本各取4 ml，加至1 個50 ml 離心管中并充分混合，計數混合細胞密度并離心濃縮，再以0.9%氯化鈉溶液將混合細胞配制為1×106、5×105、1×105、5×104、1×104個/ml 不同密度但體積均為15 ml 的細胞懸液，裝入50 ml 透明離心管中；將密度標簽貼附在離心管外壁，透過細胞懸液觀察標簽，并記錄觀察結果；隨后將密度標簽分別貼附在裝有12 例胸/腹水樣本的離心管外壁，根據上述觀察結果評估各例樣本密度，并與細胞計數結果進行比對。

1.4 細胞石蠟芯片制作及切片

12 例胸/腹水樣本漩渦震蕩15 s 混勻，各取40 ml 加入本裝置離心管中，2 000 ×g 離心15 min，傾去上清液后，加入10 ml 95%乙醇，2 000 ×g 離心15 min，室溫靜置15 min，擰開上管蓋傾去上清液。擰開下管蓋，用3.5 mm 直徑的玻璃攪拌棒從管內自下管口推出細胞團塊，記錄細胞團塊直徑和長度，放入包埋盒，以全自動脫水機（Sakura，VIP6 AI）進行常規脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，制成細胞石蠟芯片。隨后進行石蠟切片，切片厚度為4 μm，以防脫載玻片撈片，60 ℃烤至干片，4 ℃保存，1 個月內完成檢測。

1.5 HE 染色、ICC 染色和結果評估

細胞芯片石蠟切片采用全自動染色封片機（Leica，CV5030）進行HE 染色，采用全自動免疫組化儀（Ventana，BenchMark ULTRA）進行廣譜細胞角蛋白（pan cytokeratin，CK pan）（安必平，IM067）、細胞核相關抗原（nuclear-associated antigen ki-67，Ki-67）（Ventana，5278384001）ICC 染色。在光學顯微鏡下觀察染色結果，并采集圖像，分別對細胞形態和ICC 染色陽性信號的表達部位、強度、陽性細胞百分比、染色背景等進行評估。

2 應用效果

2.1 細胞離心管驗證結果

以該細胞離心管3D 模型承裝50 ml 蒸餾水，2 000 ×g 離心15 min，判定標準為管體無變形，管口無漏液。經驗證，性能符合要求。

2.2 密度標簽驗證結果

透過離心管和不同濃度細胞懸液，觀察密度標簽（圖3），記錄標簽2 個區域內的黑色橫線是否可以被清晰分辨，結果如表1 所示。

圖3 密度標簽觀察結果

采用密度標簽，參照表1 所述標簽觀察結果，評估12 例胸/腹水樣本細胞密度，并采用細胞計數板計數細胞密度，結果如表2 所示。

表1 密度標簽觀察結果

表2 脫落細胞樣本信息

2.3 細胞團塊和石蠟芯片

胸、腹水樣本各取40 ml，以本研究設計的細胞離心管，制作為長度不一（表2）但直徑均為4 mm 的圓柱形細胞團塊（圖4A）。其中有2 例樣本（P1、A6）細胞數量過少無法直接采用本裝置制作為細胞團塊，取該2 例樣本各120 ml，分3 管離心，隨后將3 管沉渣混合至1 管中，以0.9%氯化鈉溶液重懸為40 ml，再行離心制作細胞團塊。隨后將12 例胸/腹水樣本圓柱形細胞團塊按順序排列，制作為細胞石蠟芯片，然后切片并進行染色（圖4B）。

圖4 細胞團塊及細胞石蠟芯片

2.4 HE 染色和ICC 染色結果

細胞芯片石蠟切片HE 染色結果顯示（圖5A～B），細胞密度適中且無重疊，形態完整，核、膜、質結構清晰；ICC 染色結果顯示（圖5C～F），細胞形態完整，無脫片現象，CK pan 和Ki67 陽性信號清晰，定位準確。

圖5 HE 染色和ICC 染色結果（200 ×）

3 討論

液體中顆粒成分密度越高，渾濁度越高，透過液體觀察某一物體的清晰度則越低[11]。根據這一原理，本研究設計了一種密度標簽，將此標簽貼附在裝有細胞懸液的透明離心管外壁，透過細胞懸液觀察標簽，以標簽2 個區域中的黑色雙線是否清晰可見來評估細胞懸液密度。本研究對12例胸/腹水樣本進行了評估，發現密度標簽評估結果和細胞計數結果基本符合，該結果提示，較目測，采用此密度標簽可更有效地區分密度高于或低于5×105個/ml 的體液樣本。

本研究進一步采用特殊設計的細胞離心管，制作了細胞團塊，結果顯示，體液樣本中的細胞數量與采用本裝置制成的細胞團塊體積并不成正比，推測是由于體液中所含細胞類型和比例差距較大導致。以體液樣本體積為40 ml 計算，當細胞密度在5×105個/ml 以上，即可采用本裝置一步獲取直徑為4 mm、長度在1 mm 以上可用于進行石蠟包埋的細胞團塊；但當細胞密度不足5×105個/ml，則需要進行預濃縮，才能使用本裝置制作細胞團塊。本研究的12 例樣本中，僅有2 例（胸水、腹水各1 例）需要進行預濃縮，因此本研究設計的離心管適用于絕大部分胸/腹水樣本細胞團塊的制作。

采用本裝置處理脫落細胞樣本，不但能夠更準確地預估樣本中的細胞數量是否滿足制作蠟塊所需，幫助技術人員確定所需樣本體積；還可實現加樣后一次直接成型，獲得直徑一致的圓柱形細胞團塊，團塊緊致不易松散丟失細胞，包埋切片后可形成直徑基本相同的圓點，且無外源性物質，對HE染色和ICC 染色結果無影響。上述結果提示本裝置臨床應用效果較好。目前尚無類似裝置在臨床應用，因此本裝置已申請國家實用新型專利并已受理（受理號202220169770.9）。

由于痰液、尿液、腦脊液等樣本中細胞含量較少，本裝置目前的設計并不適用上述檢測，我們還將進一步研究低細胞含量樣本的處理方法。

4 結論

本研究介紹了一種可用于脫落細胞樣本固定、細胞密度估算和細胞團塊制作的裝置，該裝置適用于細胞密度在5×105個/ml 以上的胸、腹水樣本，能夠提高檢測效率，且有利于建立標準化的脫落細胞檢測流程，具有較高的臨床應用價值。