HD-BioP3 細胞電轉染條件的優化

王亞萍，宋路萍，邢體坤，李靜波，張靜靜（通信作者）

河南晟明生物技術研究院有限公司 （河南新鄉 453500）

電轉染主要通過物理電流擊穿細胞膜形成瞬時孔隙，目的基因通過孔隙進入細胞[1]，這種方法具有操作簡便、毒性小、電轉染效率較高等優點，其轉染效率通常在30%～90%之間[2-4]。電轉染在克隆操作以及表達中具有重要作用，因此，提升基因電轉染效率是當前基因工作研究人員關注的重點問題[5]。電轉染效率受很多因素的影響，包括電轉染緩沖液[6-8]、電轉染程序[9-11]、細胞數量[12]、電轉染質粒量[13-15]、電轉染前后溫度[16]等。不同的細胞系有不同的最佳電轉染條件[17]。哺乳動物細胞的電轉染通常在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、PBS+蔗糖或培養基中進行[18-19]。本研究分析電轉染緩沖液、電轉染溫度和電轉染質粒量3 個因素對細胞活率及電轉染效率的影響，從而確定HD-BioP3 細胞的最佳電轉染條件。

1 材料與儀器

1.1 材料

HD-BioP3 細胞購自Horizon 公司；GFP 質粒購自Lonza 公司；EX-CELL?CD CHO Fusion 培養基、L-Glutamine solution、蔗糖購自默克公司；CD Forti CHOTM培養基、PBS 購自賽默飛世爾科技公司；0.2%臺盼藍溶液購自Countstar 公司。

1.2 儀器

電穿孔系統（品牌：Bio-Rad 伯樂，型號：Gene Pulser Xcell，用于轉染每種細胞類型的模塊化電穿孔系統）；疊加式恒溫振蕩器（品牌：精騏，型號：IS-RDS6C，帶CO2）；二氧化碳培養箱（品牌：Heal Force，型號：HF90）；潔凈工作臺（品牌：蘇凈安泰，型號：SW-CJ-2FD）；電熱恒溫水浴鍋（品牌：上海一恒，型號：HWS-28）；全自動熒光細胞分析儀（品牌：Countstar，型號：Rigel S2）；離心機（品牌：Eppendorf，型號：5804R）。

2 實驗方法

2.1 HD-BioP3細胞電轉染優化前準備

37 ℃水浴復蘇一支HD-BioP3 細胞，待細胞生長至1.5×106～4.0×106cells/ml 時，按0.2×106cells/ml 接種至生長培養基（含4 mmol/L L-Glutamine solution的CD Forti CHOTM培養基）中；電轉染前一天將細胞以0.5×106cells/ml 接種至生長培養基中培養（培養條件：轉速為120 rpm，二氧化碳濃度為5%，溫度為37 ℃，振幅為26 mm），24 h 后用于電轉染優化。

2.2 HD-BioP3細胞電轉染優化

2.2.1 HD-BioP3細胞電轉染緩沖液和電轉染溫度優化

準備PBS、PBS+5%蔗糖、EX-CELL?CD CHO Fusion 培養基、CD Forti CHOTM培養基4 種介質作為電轉染緩沖液并分別標記為Buffer1～Buffer4 備用；取2.1 中準備的細胞，將0.2%臺盼藍溶液與細胞懸液按照1‥1 比例混合，采用全自動熒光細胞分析儀對細胞進行計數；根據計數結果取5×106個細胞，以220 rcf 速度離心5 min，棄上清液；取電轉染緩沖液 600 μl 重懸細胞，再加入20 μg GFP 質粒，輕輕吹打混勻細胞和質粒轉入電擊杯，按上述步驟，Buffer1～Buffer4 各做兩組，一組于常溫條件下進行電擊，另一組于4 ℃條件下放置5 min 后進行電擊。電擊參數設置如下，電壓為300 V，電容為950 μF，脈沖為指數衰減，將電擊后的細胞迅速轉至含預熱后的5 ml 生長培養基的T25 方瓶中，溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為5%，濕化過夜培養。

2.2.2 HD-BioP3細胞電轉染質粒量優化

根據2.2.1 選擇合適的電轉染緩沖液和電轉染溫度，在10～100 μg 之間設置10 個梯度的電轉染質粒量進行最佳電轉染質粒量的優化，電擊參數設置如下，電壓為300 V，電容為950 μF，脈沖為指數衰減，將電擊后的細胞迅速轉到含預熱后的5 ml 生長培養基的T25 方瓶中，溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為5%，濕化過夜培養。

2.3 分析方法

HD-BioP3 細胞電轉染優化24 h 后，用0.2%臺盼藍溶液與細胞懸液按照1‥1 比例混合，采用全自動熒光細胞分析儀對細胞進行電轉染效率檢測及計數。

3 結果分析

3.1 HD-BioP3細胞電轉染緩沖液和電轉染溫度優化結果分析

電轉染效率檢測結果顯示，在常溫條件下Buffer1～Buffer4的細胞電轉染效率依次為8.4%、18.8%、48.8%、22.4%，在4 ℃條件下Buffer1～Buffer4 的細胞電轉染效率依次為20.9%、25.2%、67.3%、15.7%；Buffer1 在常溫和4 ℃條件下的細胞電轉染效率相差12.5%，依次類推，Buffer1～Buffer4 在常溫和4 ℃條件下的細胞電轉染效率相差在6.4%～18.5%之間；在同一溫度下，4 種電轉緩沖液的電轉染效率差距較大，在常溫條件下，Buffer2 和Buffer4 的細胞電轉染效率相差3.6%，而Buffer3 和Buffer1 的細胞電轉染效率相差40.4%，因此在常溫條件下細胞電轉染效率相差3.6%～40.4%，依此類推，在4 ℃條件下細胞電轉染效率相差4.3%～51.6%（圖1～4）。

圖1 在常溫條件下HD-BioP3細胞電轉染24 h 后電轉染效率

圖2 在4 ℃條件下HD-BioP3細胞電轉染24 h 后電轉染效率

HD-BioP3 細胞電轉染優化24 h 后，結果顯示，在常溫條件下，Buffer1 和Buffer3 細胞活率均＆gt;80%，Buffer4 細胞活率＆lt;60%（圖3）；在4 ℃條件下Buffer3 細胞活率＆gt;80%，Buffer1 和Buffer4 細胞活率＆lt;60%（圖4）。

圖3 常溫條件下HD-BioP3細胞在電轉緩沖液Buffer1～Buffer4中細胞活率和電轉染效率

圖4 在4 ℃條件下HD-BioP3細胞在電轉緩沖液Buffer1～Buffer4中細胞活率和電轉染效率

3.2 HD-BioP3細胞電轉染質粒量測試

根據3.1 選擇細胞轉染效率和細胞活率均最高的實驗條件，即選擇Buffer3 作為電轉染緩沖液在4 ℃條件下進行電轉染質粒量優化，結果顯示，隨著電轉染質粒量的增加，細胞活率呈逐漸下降，10～30 μg 電轉染質粒量細胞活率＆gt;70%，40～70 μg 電轉染質粒量細胞活率在60%～65%之間，80～100 μg 電轉染質粒量細胞活率均＆lt;50%。隨著電轉染質粒量的增加，電轉染效率逐漸升高；電轉染質粒量為30 μg 時電轉染效率達到平臺期，電轉染質粒量＆gt;70 μg 時電轉染效率出現下降趨勢，電轉染質粒量不同造成電轉染效率最大相差24.6%（圖5～7）。

圖5 HD-BioP3細胞電轉染24 h 后電轉染效率

圖6 HD-BioP3細胞電轉染24 h 后電轉染效率

圖7 HD-BioP3細胞不同電轉染質粒量細胞活率和電轉染效率

4 討論

電轉染是一種常用的細胞轉染方法[20]，目的基因能否進行表達，取決于表達目的基因能否成功進入細胞[21]；這種電轉染方式雖然操作簡單，電轉染效率高，但不合適的電轉染條件容易導致細胞無法形成電穿孔或死亡，造成電轉染效率下降[22]。

本研究結果顯示，在測試3 個因素對電轉效率的影響實驗中，不同電轉染緩沖液對電轉染效率影響最大相差51.6%，其次為不同電轉染質粒量，電轉質粒量對電轉染效率影響最大相差24.6%，電轉染溫度影響較小，不同電轉染溫度對電轉染效率影響最大相差18.5%。故在EX-CELL?CD CHO Fusion 作為電轉染緩沖液、電轉染溫度為4 ℃、電轉染質粒量為30 μg 的條件下，電轉染效果最好。

綜上所述，優化HD-BioP3 細胞的電轉染條件，可為研究外源基因電轉染HD-BioP3 細胞提供基礎數據。