利用關(guān)鍵性狀分子標(biāo)記輔助選育食用木薯新品系

許豐收 趙笑 孫粉杏 嚴(yán)華兵 陳新 王文泉

摘??要：木薯是世界熱區(qū)重要的糧食作物，培育高β-胡蘿卜素、低生氰糖苷和口感軟糯的食用品系是木薯重要的育種目標(biāo)之一。為了高效地從育種材料中篩選出優(yōu)良食用木薯品系，本研究基于生氰糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)基因MATE編碼區(qū)G→A突變導(dǎo)致氨基酸變化進(jìn)而影響其跨膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的前人研究成果，開(kāi)發(fā)了MATE-SNAP標(biāo)記，并聯(lián)合使用β-胡蘿卜素PSY2-SNAP和糯質(zhì)GBSSⅠ-SNAP標(biāo)記從50份種質(zhì)資源中篩選出攜帶1～2個(gè)目的等位基因的親本材料12份，根據(jù)花期在不同年份共配制雜交組合10個(gè)。通過(guò)對(duì)雜交種子進(jìn)行育苗、移栽和初步考種，依據(jù)實(shí)生苗分枝特點(diǎn)，選擇直立不分枝或中高位分枝的株系134個(gè)，利用MATE/PSY2/GBSSⅠ-SNAP分子標(biāo)記進(jìn)行基因型鑒定，從中篩選出13個(gè)聚合了2～3個(gè)目的基因型的候選食用木薯品系。采用分光光度法對(duì)13個(gè)品系塊根薯肉的氰化物含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)對(duì)照SC9的氰化物含量為49.24?μg/g，新品系氰化物含量為38.82～76.51?μg/g；利用丙酮比色法對(duì)塊根薯肉的β-胡蘿卜素含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)對(duì)照SC9的β-胡蘿卜素含量為184.75?μg/hg，6個(gè)黃色薯肉新品系β-胡蘿卜素含量為101.58～154.10?μg/hg；利用雙波長(zhǎng)分光光度法對(duì)2個(gè)GBSSⅠ-SNAP標(biāo)記基因型為純合糯質(zhì)GG的品系塊根進(jìn)行支鏈淀粉含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)P13-1和V7-14的支鏈淀粉含量分別為82.46%和83.79%。對(duì)13個(gè)品系的塊根薯肉進(jìn)行食味評(píng)分，發(fā)現(xiàn)A5-138、A2-213、P7-6、P9-6、V4-8和V4-19等5個(gè)品系的評(píng)分較高，是潛在的食用木薯新品種。綜上，利用分子標(biāo)記輔助選擇可以快速和準(zhǔn)確地從育種材料中篩選出目的品系，提高木薯品種改良效率。

關(guān)鍵詞：木薯；β-胡蘿卜素；生氰糖苷；分子標(biāo)記中圖分類號(hào)：S533??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Screen?New?Edible?Cassava?Lines?Assisted?by?Molecular?Markers?of?Key?Traits

XU?Fengshou1，2，?ZHAO?Xiao2，3，?SUN?Fenxing2，4，?YAN?Huabing5，?CHEN?Xin2*，?WANG?Wenquan1

1.?College?of?Tropical?Crops，?Hainan?University，?Haikou，?Hainan?570228，?China;?2.?Institute?of?Tropical?Bioscience?and?Biotechnology，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences?/?Key?Laboratory?for?Biology?and?Genetic?Resoures?of?Tropical?Crops?of?Hainan?Province，?Hainan?Institute?of?Tropical?Agricultural?Resources，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?3.?College?of?Plant?Science?&?Technology，?Huazhong?Agricultural?University，?Wuhan，?Hubei?430070，?China;?4.?College?of?Life?Science，?Nanjing?Agricultural?University，?Nanjing，?Jiangsu?210095，?China;?5.?Cash?Crops?Research?Institute，?Guangxi?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Nanning，?Guangxi?530007，?China

Abstract：?Cassava?is?an?important?food?crop?in?tropical?regions，?and?one?of?the?main?breeding?goals?is?to?cultivate?new?lines?with?high?β-carotene，?low?cyanogenic?glucoside?and?waxy?taste.?In?order?to?screen?promising?edible?lines?from?breeding?materials，?the?study?developed?a?MATE-SNAP?marker?based?on?a?mutation?of?G→A?in?the?coding?region?of?cyanogenic?glucoside?transporter?gene?MATE?which?resulted?to?amino?acid?change?and?affected?its?transmembrane?structure?stability.?Combining?with?the?β-carotene?PSY2-SNAP?and?waxy?quality?GBSSⅠ-SNAP?markers，?12?parent?lines，?carrying?1-2?target?alleles，?were?selected?from?50?cassava?germplasms，?and?totally?hybridized?10?cross-combinations?according?to?flowering?period?among?different?years.?Firstly，?134?erect?or?middle?branched?candidate?lines?were?screen?out?through?seedling，?transplanting?and?preliminary?field?trial.?Secondly，?13?edible?promising?lines?which?aggregated?2-3?target?alleles，?were?chosen?by?using?MATE/PSY2/GBSSⅠ-SNAP?markers?together.?The?content?of?of?cyanogenic?glucoside?in?root?flesh?was?determined?by?spectrophotometry，?the?value?of?SC9?was?49.24?μg/g，?and?those?of?13?promising?lines?were?in?the?range?of?38.82-76.51?μg/g;?the?content?of?β-carotene?in?root?flesh?was?determined?by?acetone?colorimetry，?the?value?of?SC9?was?184.75?μg/hg，?and?those?of?the?six?yellow-root?lines?were?within?the?limits?of?101.58-154.10?μg/hg;?the?content?of?amylopectin?in?root?flesh?was?determined?by?dual?wavelength?spectrophotometry，?the?values?of?P13-1?and?V7-14，?whose?alleles?were?GG?that?genotyped?by?GBSSⅠ-SNAP?marker，?was?82.46%?and?83.79%，?respectively.?Based?on?this，?5?lines，?A5-138，?A2-213，?P7-6，?V4-8?and?V4-19，?were?found?to?be?the?potential?new?edible?cassava?varieties?by?taste?grading.?In?conclusion，?marker-assisted?selection?can?quickly?and?accurately?screen?out?the?target?lines?from?breeding?materials?and?improve?the?efficiency?of?cassava?genetic?improvement.

Keywords：?cassava;?β-carotene;?cyanogenic?glucoside;?molecular?marker

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.005

木薯是重要的熱帶塊根作物，是全球第六大糧食作物。我國(guó)木薯種植主要集中在廣西、海南和廣東等熱帶?。▍^(qū)），作為變性淀粉和燃料乙醇的主要原料。木薯塊根淀粉含量一般在25%左右，是一種高能食物來(lái)源[1]。木薯自19世紀(jì)20年代傳入我國(guó)，至今已有200年的栽培歷史，由于其粗生、易植、高產(chǎn)和四季皆可收獲食用等特性，一直是貧困地區(qū)居民保障溫飽的糧食作物。為了改善口感方便食用，人們開(kāi)發(fā)出了各種各樣的木薯食品和小吃，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院木薯研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)歸納整理和創(chuàng)新，編撰了中英文雙語(yǔ)《中國(guó)木薯食譜》[2]。

近年來(lái)，我國(guó)木薯種植面積和產(chǎn)量持續(xù)下降，而需求卻持續(xù)增長(zhǎng)，每年木薯進(jìn)口量持續(xù)增加，2019年進(jìn)口原淀粉和干片達(dá)到1700萬(wàn)t（折合干片），是國(guó)內(nèi)產(chǎn)量的6倍左右（據(jù)中國(guó)淀粉工業(yè)協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)）。國(guó)際木薯淀粉和工業(yè)酒精市場(chǎng)維持低價(jià)位，導(dǎo)致木薯原料收購(gòu)價(jià)持續(xù)走低，農(nóng)戶種植積極性缺乏。木薯塊根營(yíng)養(yǎng)豐富，除富含淀粉外，鉀、鈣、鎂、鐵等礦質(zhì)元素較豐富，還含有β-胡蘿卜素和維生素等，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比肩甘薯和馬鈴薯[3]。隨著大健康時(shí)代的到來(lái)，人們對(duì)膳食均衡需求不斷增強(qiáng)，加強(qiáng)木薯食用價(jià)值的開(kāi)發(fā)和利用，培育食用木薯新品種，推動(dòng)木薯食用化發(fā)展，將促進(jìn)我國(guó)木薯產(chǎn)業(yè)高效益發(fā)展。

木薯因其塊根中生氰糖苷含量的不同分為苦木薯和甜木薯，食用苦木薯會(huì)出現(xiàn)惡心、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)產(chǎn)生傷害，引起konzo病。熱帶不發(fā)達(dá)地區(qū)人們以木薯塊根及其制品為主食，導(dǎo)致維生素A缺乏并產(chǎn)生相應(yīng)疾病，如夜盲癥等[4]。常規(guī)木薯品種多為白色薯肉，β-胡蘿卜素含量低且生氰糖苷含量高于50?μg/g，因此，為了改善木薯的食用品質(zhì)，降低塊根中生氰糖苷含量，提高塊根中的β-胡蘿卜素含量并改良薯肉的外觀色澤，木薯科研工作者做了大量工作，取得一些重要進(jìn)展。生氰糖苷主要在木薯葉片中合成，再通過(guò)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到塊根中。木薯葉片受到害蟲(chóng)或動(dòng)物吸/啃食后，位于液泡中的生氰糖苷與細(xì)胞壁或乳管中的β-葡萄糖苷酶互作，釋放出氰化氫（HCN）使害蟲(chóng)和動(dòng)物中毒，故生氰糖苷在木薯植株內(nèi)具有一定的防御功能[5]。多家科研機(jī)構(gòu)聯(lián)合測(cè)定了3354個(gè)巴西木薯品系，以及部分非洲種質(zhì)多年多點(diǎn)的塊根生氰糖苷含量，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)主效位點(diǎn)，其中第16號(hào)染色體上的多種藥物和外運(yùn)（MATE）蛋白可貢獻(xiàn)塊根中30%的生氰糖苷含量的變異。MATE蛋白編碼基因第4個(gè)外顯子G→A突變，使該位點(diǎn)編碼的氨基酸由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白跨膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定或構(gòu)象發(fā)生改變，生氰糖苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率明顯下降或喪失[6]。在木薯塊根β-胡蘿卜素合成途徑中，八氫番茄紅素合成酶是參與β-胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶，木薯基因組中有3個(gè)編碼八氫番茄紅素合成酶的基因，分別命名為PSY1～3，其中PSY2基因編碼序列第572個(gè)堿基C→A的突變，導(dǎo)致編碼氨基酸由丙氨酸變成天冬氨酸，氨基酸的改變使PSY2的活性增至3倍以上，從而提高了塊根β-胡蘿卜素的含量，且該突變位點(diǎn)為木薯特有，在JGI數(shù)據(jù)庫(kù)的其他物種中尚未發(fā)現(xiàn)[7-8]。國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心（CIAT）通過(guò)自交在木薯品系A(chǔ)M206-5的S1代中發(fā)現(xiàn)1個(gè)糯性淀粉突變體，泰國(guó)木薯發(fā)展研究所（TTDI）進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)糯木薯品系的GBSSⅠ基因在第6個(gè)外顯子上有1個(gè)堿基C缺失，產(chǎn)生移碼突變導(dǎo)致酶活喪失[9]。低氰苷、高β-胡蘿卜素和糯性等性狀的形成機(jī)理的解析奠定了木薯食用品種選育的理論基礎(chǔ)。

利用前期根據(jù)β-胡蘿卜素合成基因PSY2、GBSSⅠ的單堿基變異開(kāi)發(fā)的單核苷酸擴(kuò)增多態(tài)性（SNAP）標(biāo)記[9-10]，與本研究開(kāi)發(fā)的MATE-SNAP標(biāo)記（生氰糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因）對(duì)國(guó)內(nèi)主栽品種和引進(jìn)優(yōu)良品種進(jìn)行基因型鑒定，篩選一批親本配制不同雜交組合，并對(duì)雜交實(shí)生苗及其繁殖后代株系進(jìn)行基因型和品質(zhì)指標(biāo)鑒定，選育聚合了高β-胡蘿卜素、低生氰糖苷或糯質(zhì)性狀的食用木薯新品種/系。

1??材料與方法

1.1??材料

木薯雜交親本種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所文昌試驗(yàn)基地，采用分期播種（每個(gè)品系間隔30?d，共種植3次）的方法增加花期相遇的幾率。常規(guī)管理，氮肥減半，適當(dāng)打頂以促進(jìn)開(kāi)花。親本信息見(jiàn)表1。

采用人工授粉套袋隔離的方式配制雜交組合，收獲雜交種子后利用育苗盆育苗，于出苗60?d左右移栽大田。次年初收獲單株，淘汰長(zhǎng)勢(shì)差和塊根產(chǎn)量偏低的個(gè)體，根據(jù)種莖狀況每個(gè)單株栽種1～2行株系，年底考種測(cè)定產(chǎn)量和食用品質(zhì)相關(guān)性狀。

新選048（XX048）及其28個(gè)自交S1代株系（XXS1-1～28）種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院科研基地，常規(guī)管理。

1.2??方法

1.2.1??DNA抽提??采集木薯植株頂部幼嫩葉片，低溫研磨成粉狀，參照植物基因組DNA提取試劑盒（成都福際生物技術(shù)有限公司）的流程提取DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，并用NanoDrop紫外分光光度計(jì)（Thermo，?USA）檢測(cè)DNA濃度，稀釋至50?ng/μL，于–20?℃冰箱保存，備用。

1.2.2??SNAP引物設(shè)計(jì)??從美國(guó)能源部生物信息網(wǎng)站（www.phytozome.com）下載MATE基因的完整序列，找到G→A突變位點(diǎn)，根據(jù)SNAP技術(shù)引物設(shè)計(jì)原則，利用NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.?nih.gov/）中的Primer?BLAST程序進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并將反向引物3'端倒數(shù)第3個(gè)堿基依據(jù)SNAP引物設(shè)計(jì)的原則將Ａ錯(cuò)配為T(mén)，以保證引物對(duì)能夠特異地區(qū)分2個(gè)不同的等位基因。本研究用到的引物序列見(jiàn)表2。

1.2.3??PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物多態(tài)性檢測(cè)??通過(guò)對(duì)基因組DNA用量和PCR擴(kuò)增退火溫度、延伸時(shí)間及循環(huán)數(shù)的調(diào)整和優(yōu)化，確定MATE-SNAP引物組合的PCR擴(kuò)增體系參數(shù)：100?ng?DNA，2×PCR?master?mixture?（Vazyme，?CHN）?10?μL，每條引物0.5?μL，加雙蒸水至總體積20?μL；PCR反應(yīng)條件為：94?℃?3?min；94?℃?30?s，60.5?℃?30?s，72?℃?1?min，32個(gè)循環(huán)；72?℃?5?min。PSY2/GBSSⅠ-SNAP引物組合的PCR擴(kuò)增體系參數(shù)參照文獻(xiàn)[9-10]。所有PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并用Tanon?4000凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）進(jìn)行拍照。每個(gè)PCR反應(yīng)至少重復(fù)2次，以確保試驗(yàn)結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。

1.2.4??塊根薯肉顏色評(píng)估、類胡蘿卜素、氰化物含量和支鏈淀粉比率測(cè)定??薯肉顏色評(píng)估：田間收獲塊根時(shí)，每個(gè)株系選取3個(gè)來(lái)自不同單株的塊根，橫切后記錄塊根顏色并留存蒸煮前后的照片。

β-胡蘿卜素含量采用丙酮提取比色法測(cè)定[11]。木薯塊根氰化物采用苦味酸顯色法測(cè)定[12]（海南省苦味酸屬于管制藥品，現(xiàn)階段無(wú)法購(gòu)買(mǎi)，因此后期采用分光光度法）；木薯塊根氰化物采用分光光度法測(cè)定[13-14]。木薯塊根淀粉支鏈淀粉含量采用雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定[15]。所有樣品設(shè)3次試驗(yàn)重復(fù)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5??塊根蒸煮后食味評(píng)分??參照《熱帶作物品種區(qū)域試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程?木薯》（NY/T?2446—2013）[16]進(jìn)行食味評(píng)價(jià)，略有改動(dòng)。木薯塊根收獲當(dāng)天，洗凈并去掉薯皮，選擇2～3條中段薯塊，切成0.5?cm厚度的薯片20片左右，蒸煮30?min。安排10名人員品嘗，并對(duì)蒸熟薯片從香度、苦度、甜度、粉度、粘度和纖維感分別進(jìn)行打分，最后計(jì)算每個(gè)株系的綜合評(píng)分。

2??結(jié)果與分析

2.1??MATE-SMAP標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)及其準(zhǔn)確性分析

根據(jù)MATE蛋白編碼基因第4個(gè)外顯子的G→A突變，參考PSY2-SNAP標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)原理，本研究也設(shè)計(jì)了一組SNAP引物（表2）。在優(yōu)化PCR反應(yīng)體系后，對(duì)新選048及其28個(gè)自交F1代株系進(jìn)行MATE基因G→A突變位點(diǎn)的基因型鑒定，通過(guò)電泳圖（圖1）可以發(fā)現(xiàn)，新選048在該位點(diǎn)是雜合AG，28個(gè)自交S1代株系在該位點(diǎn)存在分離，其中AA型16個(gè)、AG型9個(gè)和GG型3個(gè)，群體的偏分離趨向AA型（可能是群體太小的緣故）。采用苦味酸顯色法對(duì)新選048和28個(gè)自交S1代植株塊根薯肉氰化物含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)氰化物含量在自交S1代群體中存在變異，且AA型株系的薯肉氰化物含量均小于50?μg/g，GG型和AG型株系薯肉偏向于高氰化物含量（表3）。

2.2??親本選擇、雜交組合配制和實(shí)生苗子代選優(yōu)

為了配制雜交組合，選育薯肉高β-胡蘿卜素、低生氰糖苷或糯性淀粉的食用木薯新品系，本研究利用3組MATE/PSY2/GBSSⅠ-SNAP標(biāo)記對(duì)近50個(gè)候選親本的基因型進(jìn)行鑒定，并從中篩選出12個(gè)親本品種（表1）。利用這12個(gè)親本于2016—?2018年分別進(jìn)行人工授粉雜交，其中2016年V系列，2017年P(guān)系列，2018年A系列，總計(jì)10個(gè)組合。通過(guò)對(duì)雜交種子進(jìn)行育苗、移栽和初步考種，根據(jù)實(shí)生苗分枝特點(diǎn)，選擇直立不分枝或中高位分枝（1次分枝部位一般高于1.5?m）的子代株系進(jìn)行基因型篩選。每個(gè)組合選擇4～44個(gè)候選株系，總計(jì)134個(gè)株系（表4）。

2.3??育種株系的基因型鑒定和優(yōu)良品系篩選

為了對(duì)育種株系食用品質(zhì)相關(guān)基因的基因型進(jìn)行鑒定，選擇聚合塊根高β-胡蘿卜素、低生氰糖苷和糯質(zhì)等位基因的優(yōu)良株系，同樣利用3組MATE/PSY2/GBSSⅠ-SNAP標(biāo)記對(duì)134個(gè)株系進(jìn)行基因型鑒定，從中篩選出13個(gè)目的品系（圖2，表5），其中高β-胡蘿卜素AC基因型品系6個(gè)，

低生氰糖苷純合AA基因型品系12個(gè)，糯質(zhì)GG基因型品系7個(gè)；聚合高β-胡蘿卜素AC基因型和低生氰糖苷AA基因型品系6個(gè)；聚合低生氰糖苷AA基因型和糯質(zhì)GG基因型品系6個(gè)；聚合高β-胡蘿卜素AC基因型、低生氰糖苷AA基因型和糯質(zhì)GG基因型品系1個(gè)（P7-6）。

2.4??優(yōu)良品系塊根氰化物、β-胡蘿卜素、支鏈淀粉含量測(cè)定和食味評(píng)分

在確定13個(gè)優(yōu)良品系和3個(gè)對(duì)照品系基因型的基礎(chǔ)上，于2021年底收獲木薯塊根，去掉薯皮后對(duì)薯肉進(jìn)行氰化物和β-胡蘿卜素含量測(cè)定（表5）。15個(gè)低生氰糖苷AA基因型品系塊根的氰化物含量為（38.82±0.57）～（77.37±2.14）μg/g，平均氰化物含量為59.86?μg/g，其中A5-079和V1-6的氰化物含量低于食用木薯主栽品種SC9。β-胡蘿卜素含量為（45.72±6.67）～（198.15±15.64）μg/hg，其中基因型為AA的ZMC723含量最高，為（198.15±?15.64）?μg/hg；基因型為AC的品系中SC9含量最高，泰引1號(hào)和A5-138次之，平均含量為145.93?μg/hg；基因型為CC的品系中A5-079含量最高，為（118.63±4.70）μg/hg，平均含量為79.94?μg/hg。除A5-079外，塊根β-胡蘿卜素含量大于100.0?μg/hg的其他品系薯肉顏色基本為淡黃色和黃色。

從糯質(zhì)基因型為GG的品系中選取P13-1和V7-14進(jìn)行支鏈淀粉含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其支鏈淀粉含量分別為82.46%±0.42%和83.79%±1.40%，高于木薯淀粉支鏈淀粉平均含量75.55%±1.81%[17]。

進(jìn)而，以食用木薯主推品種SC9、引進(jìn)食用品種泰引1號(hào)和高β-胡蘿卜素品系ZMC723為對(duì)照，對(duì)13個(gè)優(yōu)良品系的薯肉食味進(jìn)行評(píng)分（表5，圖3）。綜合來(lái)看，13個(gè)參試品系/種的綜合評(píng)分均超過(guò)80.0，其中A5-138的評(píng)分最高，為93.8，略低于對(duì)照SC9（94.3）；品系/種A2-213、P7-6、P9-6、V4-8和V4-19的評(píng)分均超過(guò)90.0，是潛在的食用木薯新品系。

3??討論

3.1??MATE-SNAP標(biāo)記是一個(gè)具有育種價(jià)值的分子標(biāo)記

本研究根據(jù)前人發(fā)現(xiàn)的生氰糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MATE基因的關(guān)鍵突變位點(diǎn)開(kāi)發(fā)了SNAP分子標(biāo)記[6]，并利用一個(gè)小規(guī)模的自交群體驗(yàn)證其可靠性，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)為AA基因型的木薯品系塊根生氰糖苷含量低。隨后，利用MATE-SNAP標(biāo)記對(duì)育種材料進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)MATE-SNAP基因型為AA的品種/系塊根平均生氰糖苷含量為59.86?μg/g，略高于食用木薯主栽品種SC9（49.24?μg/g），其中A05-079和V1-6品系低于SC9。因此，MATE-SNAP標(biāo)記有助于育種工作者從中間材料中篩選出低生氰糖苷品系，縮小檢測(cè)范圍，提高選育效率。

3.2??木薯生氰糖苷合成和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制復(fù)雜，亟需深入研究發(fā)掘更多關(guān)鍵基因

木薯中的生氰糖苷主要有亞麻苦苷和百脈根苷，主要分布在葉片、莖稈和塊根中，特定條件下被分解生成氫氰酸，具有一定的毒性，長(zhǎng)期食用生氰糖苷含量高的木薯薯肉，會(huì)引起氰中毒[18]。木薯塊根生氰糖苷主要來(lái)源于葉片合成轉(zhuǎn)運(yùn)和塊根的自身合成[19]。本研究開(kāi)發(fā)的MATE-SNAP標(biāo)記是基于生氰糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MATE編碼區(qū)的單堿基變異，在一定程度上有助于篩選出生氰糖苷從葉片向塊根轉(zhuǎn)運(yùn)能力弱的木薯種質(zhì)，但如果涉及其他生氰糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或塊根自身的生氰糖苷合成，則無(wú)法企及。本研究中的12個(gè)優(yōu)良食用木薯品系雖然均為低生氰糖苷AA基因型，但其塊根氰化物含量卻存在差異，而且V7-16（AG基因型）的塊根生氰糖苷含量與AA基因型相差不大，預(yù)示還有其他基因可以影響和調(diào)控木薯塊根生氰糖苷的轉(zhuǎn)運(yùn)和合成。利用基因編輯技術(shù)敲除木薯生氰糖苷合成起始的關(guān)鍵基因MeCYP7D1和MeCYP79D2，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)敲除MeCYP79D2可以顯著減少氰化物的含量[20]，而且轉(zhuǎn)錄因子MebHLH72/114可以同時(shí)調(diào)控木薯葉片中MeCYP7D1/D2和MeCYP71E的轉(zhuǎn)錄活性[21]。另外，在杏樹(shù)和百脈根中的研究發(fā)現(xiàn)，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)調(diào)控PdCYP79D16、PdCYP71AN24和LjCYP79D3的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)影響生氰糖苷在特定組織器官內(nèi)的合成效率[22-23]。因此，加強(qiáng)木薯生氰糖苷合成和轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制研究，發(fā)掘更多關(guān)鍵基因和突變位點(diǎn)，為培育地上部生氰糖苷合成正常但生氰糖苷向木薯塊根轉(zhuǎn)運(yùn)，且塊根自身生氰糖苷合成效率低的木薯新品系，提供理論指導(dǎo)和基因資源。

3.3??關(guān)鍵性狀調(diào)控分子標(biāo)記的使用可以加速木薯新品種的選育

我國(guó)的木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展正處于瓶頸期，大力推動(dòng)木薯食用化發(fā)展，培育食用木薯新品種，是維持木薯產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要舉措之一。本研究利用低生氰糖苷MATE、高β-胡蘿卜素PSY2[10]和糯質(zhì)GBSSⅠ-SNAP[9]標(biāo)記對(duì)木薯種質(zhì)資源進(jìn)行基因型篩選，選擇合適親本材料進(jìn)行雜交組合配制，并利用分子標(biāo)記選擇聚合2～3個(gè)目的等位基因的實(shí)生苗株系或品系，再結(jié)合相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定和食味評(píng)分快速?gòu)?34個(gè)候選株系中篩選出13個(gè)優(yōu)良品系，其中5個(gè)品系食味評(píng)分較高，是潛在的食用木薯新品種。此外，由于這些優(yōu)良品系的食用品質(zhì)基因型已知，可以據(jù)此制定雜交計(jì)劃或通過(guò)自交進(jìn)一步定向改良，選育塊根生氰糖苷含量更低、β-胡蘿卜素含量增加和口感更加軟糯的新品系，從而提高木薯品種改良效率。

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