木薯MNP標記在品種鑒定中的應用

萬人靜 李瓊 周新成 李論 李甜甜 周俊飛 李莎 彭海 章偉雄 方治偉

摘??要：MNP（multiple?nucleotide?polymorphism，?MNP）是隨著分子標記技術的發展而產生的一種新型分子標記技術。靶向測序基因型技術（genotyping?by?target?sequencing，?GBTS）在一個擴增子內僅擴增一個SNP位點，MNP基于GBTS可在一個擴增子內同時擴增多個SNP位點。該技術具有成本低、檢測效率高、應用靈活、適應性廣等特點，MNP標記可用于育種過程的鑒定。為了建立快速、精準、高效的木薯品種鑒定方法，篩選適用于木薯品種鑒定的MNP分子標記，本研究在全基因組范圍內篩選高多態性區域并設計引物，最終在全基因范圍內獲得623個木薯MNP標記位點，并利用28個木薯品種對木薯MNP標記進行評價。結果表明，MNP標記分型重現性高達100%。MNP標記位點在28個木薯品種中檢出（4.07±1.68）種等位基因型，最多具有12種等位基因型。對所有木薯品種進行兩兩比較時，99.47%（376/378）的品種對間的差異大于46%，比例在0.3%～81.0%之間，均值為71.78%。相較于SNP，MNP具有更好的品種區分能力。綜上所述，本研究所開發的木薯MNP分子標記具有較高的重現性、多態性和品種區分能力，可廣泛用于木薯的種質資源多樣性、新品種培育及品種鑒定等研究。

關鍵詞：木薯；分子標記；MNP；品種鑒定中圖分類號：S667.9??????文獻標識碼：A

Application?of?Cassava?MNP?Markers?in?Variety?Identification

WAN?Renjing1，2，?LI?Qiong3，?ZHOU?Xincheng4，?LI?Lun1，2，?LI?Tiantian1，2，?ZHOU?Junfei1，2，?LI?Sha5，6，?PENG?Hai1，2，?ZHANG?Weixiong2，7，?FANG?Zhiwei1，2*

1.?School?of?Life?Science，?Jianghan?University，?Wuhan，?Hubei?430056，?China;?2.?Institute?for?Systems?Biology，?Jianghan?University，?Wuhan，?Hubei?430056，?China;?3.?Tropical?Crops?Genetic?Resources?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?4.?Institute?of?Tropical?Bioscience?and?Biotechnology，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?5.?Hubei?Key?Laboratory?of?Three?Gorges?Project?for?Conservation?of?Fishes，?Yichang，?Hubei?443100，?China;?6.?Chinese?Sturgeon?Research?Institute，?China?Three?Gorges?Corporation，?Yichang，?Hubei?443100，?China;?7.?Faculty?of?Health?and?Social?Sciences，?The?Hong?Kong?Polytechnic?University，?Hong?Kong?100872，?China

Abstract：?MNP?（multiple?nucleotide?polymorphism，?MNP）?is?a?new?molecular?marker?technology?emerged?with?the?development?of?molecular?marker?technology.?While?genotyping?by?target?sequencing?（GBTS）?amplifies?only?one?SNP?site?in?one?amplicon，?MNP?can?amplify?multiple?SNP?sites?simultaneously?in?one?amplicon?based?on?GBTS.?This?technology?has?the?features?of?low?cost，?high?detection?efficiency，?flexible?application?and?wide?adaptability，?Compared?with?SNP，?MNP?has?better?ability?to?differentiate?varieties.?In?order?to?establish?a?rapid，?accurate?and?efficient?method?for?cassava?variety?identification?and?to?screen?MNP?molecular?markers?suitable?for?cassava?variety?identification，?this?study?screened?highly?polymorphic?regions?and?designed?primers?in?the?whole?genome?range，?and?finally?obtained?623?cassava?MNP?marker?loci?in?the?whole?genome?range，?the?cassava?MNP?markers?were?evaluated?using?28?cassava?varieties.?The?results?showed?that?the?MNP?marker?typing?reproducibility?was?up?to?100%.?4.07±1.68?alleles?were?detected?in?28?cassava?varieties，?with?a?maximum?of?12?alleles.?When?all?cassava?varieties?were?compared?one?by?a?one，?99.47%?（376/378）?of?the?differences?between?pairs?were?greater?than?46%，?with?the?proportion?ranging?from?0.3%?to?81.0%，?with?a?mean?value?of?71.78%.?Meanwhile，?MNP?markers?can?be?used?for?identification?in?the?breeding?process.?In?conclusion，?the?cassava?MNP?molecular?markers?developed?in?this?study?have?high?reproducibility，?polymorphism?and?variety?differentiation?ability，?and?could?be?widely?used?for?research?on?germplasm?diversity，?new?variety?breeding?and?variety?identification?of?cassava.

Keywords：?cassava;?molecular?marker;?MNP;?variety?identification

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.007

木薯（Manihot?esculenta?Crantz）又名樹薯，為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot），在熱帶、亞熱帶地區廣泛栽植。木薯是全球三大薯類作物之一，也是第六大糧食作物，享有“淀粉之王”的盛譽[1]。木薯的用途非常廣泛，一方面木薯可作為優質雜糧，世界上有近8億人以木薯為糧食[2]；另一方面，木薯還可以被加工成不同的工業產品，例如淀粉和酒精[3]，是發展潛力巨大的能源植物。

木薯為異花授粉植物，基因型高度雜合[4]，倍性復雜，制約了傳統分子標記的開發和應用。在以往的研究中，應用于木薯的分子標記技術主要有相關序列擴增多態性（sequence-related?amplified?polymorphism，?SRAP）[5-6]、簡單重復序列（simple?sequence?repeat，?SSR）[7-11]、擴增片段長度多態性（amplified?fragment?length?polymorphism，?AFLP）[12-13]、目標起始密碼子多態性（start?codon?targeted?polymorphism，?SCoT）[14]、單核苷酸多態性（single?nucleotide?polymorphism，?SNP）[8，15-16]。這些分子標記技術在分子標記的多態性、檢測的標記數量以及檢測效率等一個或多個方面存在不足。如凝膠電泳是AFLP和SSR最常用的檢測方法，這種方法難以大規模、高通量地應用于大量樣品的檢測和分型；雖然最近也有將高通量測序技術用于SSR的高通量檢測和分型的報道，但是受到DNA聚合酶滑脫的影響，SSR在雜交種和多倍體物種的準確分型仍然是一個難點[17]。SNP是另一個目前最常用的分子標記之一，由于SNP多是二態性的，因此單個標記位點多態性不高，需要檢測大量SNP位點彌補這一缺陷。目前主要檢測手段有高通量測序和芯片法2種，這2種方法在檢測成本和檢測結果的重現性和準確性上尚有待提高。一段基因組區域內由多個SNP位點共同組合為一個標記的新型分子標記技術，即MNP標記技術，提高了單分子標記的多態性；利用擴增子測序方法在提高測序深度的同時又降低測序成本，實現了準確性和效益的雙贏。該技術已形成國標并用于水稻、玉米、棉花等16種作物的品種鑒定。目前尚沒有MNP標記技術在木薯中的研究和報道。本研究在木薯全基因組范圍內篩選MNP分子標記位點，并利用收集到的28個木薯品種對開發的木薯MNP標記進行評價。

1??材料與方法

1.1??材料

供試的28份木薯栽培品種均來自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，品種名稱以及編號見表1。

1.2??方法

1.2.1??MNP位點開發??基于前期收集的241份木薯材料的SNP信息，在全基因組范圍內篩選MNP標記位點。首先通過Bowite?2軟件將241份木薯的全基因組數據比對到木薯的參考基因組Mes culenta_305_v6（下載地址為ftp：//cassavabase.org/?Manihot_v6.1/）上，比對參數全部采用默認值。比對完成后，采用samtools?sort軟件對比對結果排序并轉存為bam格式文件，通過“-@?6-m?2G”參數設定排序時使用6個線程，內存指定用2?Gb。利用samtools?mpile軟件鑒定出所有的SNP位點，參數設置為默認數值。獲得全部的SNP位點后，通過窗口平移的方式在全基因組范圍內尋找候選的標記位點。具體操作為：選定一個125?bp的基因組區域，統計該區域內的SNP的數量，以及該區域對241份木薯的區分度（discriminative?power，DP）。區分度的計算方法為DP=n/N，n指所有材料兩兩比較時可以區分的樣品對數，N指的是比較的總樣品對數。若該區域含有≥3個SNP位點，且區分度>0.2，則該區域作為候選MNP標記位點。然后向前滑動20?bp，重新計算上述指標。對所有獲得候選MNP標記位點進行物種特異性檢查，保留物種特異性最好的作為最終的MNP標記位點。MNP引物由石家莊博瑞迪生物技術有限公司合成。

1.2.2??基因組DNA的提取與純化??將每個品種進行至少10個單株葉片混合取樣并用液氮充分研磨成粉末后采用CTAB法抽提基因組DNA。利用核酸定量儀Qubit檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

1.2.3??多重PCR擴增與文庫構建??通過兩輪PCR擴增的方法構建高通量測序文庫。第一輪為多重PCR擴增，目的是富集目標片段，其擴增體系為：引物混合物4?μL（10?μmol/L），DNA模板（20～?200?ng）x?μL，GenoPlexs?3×T?Master?Mix?10?μL，ddH2O?（16–x）μL。PCR反應程序：95?℃預變性5?min；95?℃變性20?s，60?℃退火延伸4?min，循環15次；72?℃最后延伸10?min，10?℃保溫結束反應。使用磁珠對PCR產物進行純化，方法參照說明書。第二輪PCR目的對PCR產物添加測序接頭，其擴增體系為：接頭引物F（5?μmol/L）2?μL，接頭引物R（5?μmol/L）2?μL，DNA模板（第一輪PCR純化產物）16?μL，GenoPlexs?3×T?Master?Mix?10?μL。PCR反應程序：95?℃預變性3?min；95?℃?15?s，58?℃?15?s，70?℃?30?s，循環8次；72?℃最后延伸5?min，10?℃保溫結束反應。用Qubit檢測文庫濃度，用瓊脂糖凝膠檢測文庫質量。正常文庫濃度在10?ng/μL以上，且電泳條帶單一，大小在300?bp左右。采用NovaSeq?6000進行雙末端測序，單端讀長為150?bp，測序由諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2.4??測序片段比對與MNP標記分型??測序片段比對、MNP標記分型與樣品間比較參見FANG等[18]的方法，其具體流程簡述如下：對于每一個樣品的測序數據，首先利用Bowtie?2（version?2.1.0）軟件將測序片段比對到參考基因組上。對于每個MNP位點，統計該位點上檢測到的所有等位基因型以及支持該等位基因型的測序片段數目，即該等位基因型的豐度。豐度最高的等位基因型是該位點的主等位基因型。若主等位基因型的豐度大于20，則認為該位點成功檢出。與主等位基因型的豐度比值大于0.2的其他等位基因型均記為可信等位基因型。對于每一個MNP位點，若2個樣品間的等位基因型相同，則認為這2個樣品在該MNP標記位點無差異。若同一MNP標記位點在2次重復中的分型結果無差異，則認為該位點分型結果可重現。重現率R=m/M，m指不可重現的MNP標記位點總數，M指重復間比較的MNP的標記位點總數。準確性A=1–（1–R）/2。采用perl腳本統計每個MNP位點的等位基因型數、群體內雜合子所占比率（observed?heterozy gosity，?Ho）以及區分度。為了全面與SNP技術進行比較，利用bcftools（Version?1.5）工具從測序數據中獲取每個樣品的SNP標記分型結果。分別基于MNP和SNP分型結果，兩兩比較樣品間，統計共同檢出位點以及差異位點數（基因型存在差異的位點）。

2??結果與分析

2.1??木薯MNP位點篩選

利用已公布的241份木薯的SNP信息，成功設計出623個MNP標記位點。如圖1A所示，所設計的位點均勻分布在18個染色體上（圖1A）。MNP標記長度范圍在186～274?bp之間（圖1B），絕大多數位點（427個）的長度位于270～274?bp之間。每個MNP位點包含2～26個高頻SNP（MAF>5%，平均9.06個，圖1C）。

2.2??木薯MNP位點的準確性和重現性分析

28個樣品的56個文庫共獲得11.5?Gb測序數據，獲得31?422個MNP標記分型結果，平均每個MNP標記有900.68倍的覆蓋深度。為了評估MNP標記法在木薯中的準確性和重現性，分別比較了每份木薯樣品的重復實驗檢測結果（表2）。共15?644個MNP標記位點在2次重復中均檢出，其中可重現的位點15?644個，重現性為100%，分型準確性為100%。

2.3??木薯MNP位點的多態性和品種區分能力

在28份木薯品種中，每個MNP標記位點檢出的等位基因型數目在1～12之間，平均檢出（4.07±1.68）種等位基因型，其中237個位點含有5種以上等位基因型（圖2）。在本研究中，MNP位點的觀測雜合率（Ho）在0～96.43%之間，平均值為50.61%，較高的雜合率顯示本次檢測樣本的遺傳背景較為廣泛。

為了評估MNP標記對木薯樣品的區分能力，將樣品進行兩兩比較，統計兩兩樣品間分型結果有差異的MNP標記位點比例，如圖3所示。在本次供試的28個品種中，任意2個品種間的差異位點比例在0.3%～81.0%之間（均值為71.78%），99.47%（376/378）的品種對間的差異大于46%；單個MNP標記的平均區分度為0.68，其中5個位點（MSH0091、MSH0338、MSH0470、MSH0498和MSH0557）具有極高區分度，能將95%以上的樣本區分開。

2.4??MNP標記用于木薯育種過程鑒定

我國的木薯品種主要通過引進國外品種或地方資源進行雜交選育獲得。如木薯品種SC5是通過SC8013和ZM8625的雜交后代選育而成[19]。比較兩樣品的MNP分型結果發現，SC5和SC8013共同檢出534個位點，其中532個位點（99.63%）具有相同的等位基因型，這與已知的品種培育過程一致。

2.5??基于SNP標記的重現性和品種區分能力

為了比較SNP技術在本次供試木薯品種間的區分能力，從擴增子測序數據中獲取每個樣品的SNP標記分型結果，28個木薯品種共檢出6189個SNP位點；基于這些SNP位點比較重復實驗中同一樣品分型結果的一致性，以及不同樣品間的差異位點比例。如圖4所示，相同樣品2次重復之間的差異可達2.23%～5.34%，整體分子標記的重現率為96.53%；不同樣品的SNP差異位點比例在2.72%～50.05%之間，平均值為43.19%。

3??討論

本研究首次在木薯中進行MNP分子標記技術的開發，獲得了623個MNP標記位點。這些位點均勻分布在木薯的18條染色體上，因而理論上可以用于表征全基因組水平上的遺傳特征。基于28個木薯品種的評價結果表明，這批分子標記位點具有較高的多態性和品種區分能力，且分型結果達到了100%重現，是非常理想的分子標記技術。從多態性來看，單個MNP標記最高有12種等位基因型，平均4.07個，這與目前已經報道的小麥的單個SSR的等位基因型數量相當[19-20]。從區分度看，平均每個MNP標記位點可以區分68%的品種對，5個潛在的核心位點可以區分95%的品種對；整體來看，任意2個木薯品種間平均有71.78%的位點分型結果有差異，實現了品種間高度區分。相較而言，基于SNP標記的分型，任意2個木薯品種間平均差異僅為43.19%。從重現性來看，MNP分子標記技術的重現性達到了100%，遠高于SSR和SNP的重現性[21-22]。由此可見，相較于傳統分子標記技術，MNP標記技術在分子標記的多態性、分型結果重現性以及品種區分能力等指標表現出了良好的綜合性能。同時，采用多重PCR擴增和高通量測序相結合的方法實現MNP標記分型，提高了MNP標記技術高通量、大規模的快速、準確分型的能力，在提高測序深度的同時又降低測序成本，實現了準確性和效益的雙贏。

除了基礎理論研究外，遺傳分子標記技術在生產實踐中也有大量的應用場景，如對不同種質資源和栽培品種的區分、對冒牌種子和侵權品種、實質性派生品種的判定等。這些應用場景往往與品種的管理和執法相關，因此要求分子標記技術必須具有極高的分型準確性和重現性以及檢測位點多、品種區分能力強。然而，對于木薯這種倍性復雜以及高度雜合的物種，傳統的分子標記開發難度大，可用的標記位點數量少，檢測的準確性難以滿足應用需求。本研究中開發的MNP分子標記技術有效解決了上述問題，具備用于木薯品種真實性鑒定和實質性派生品種鑒定的能力，可為木薯品種選育、打假與維權以及品種權保護提供重要技術支撐。

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