玫瑰醬中微生物多樣性分析及優(yōu)勢菌群的鑒定

續(xù)釗 ，張元馨 ，盧前明

(1.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450121；2.河南工程學(xué)院 資源與安全工程學(xué)院，鄭州 451191)

玫瑰屬于薔薇科植物[1]，多年生常綠灌木，生長在陽光充足的地方，在全球各地尤其是在北半球地區(qū)被廣泛栽培[2]。我國的玫瑰花栽培已經(jīng)有近2000年的歷史，主要栽培在甘肅、新疆、云南和山東等地，玫瑰屬于我國重要的經(jīng)濟作物[3-5]。

玫瑰花除了具有特殊的香味外，還富含多種營養(yǎng)物質(zhì)[6]，其中維生素、脂肪酸和多種礦物質(zhì)化合物含量最為豐富[7]。已有研究表明[8]，在云南地區(qū)可食用玫瑰中主要的營養(yǎng)成分有維生素C、粗纖維和蛋白質(zhì)[9]。而食用玫瑰中的營養(yǎng)成分和礦物質(zhì)元素也多于普通的蔬菜，此外，食用玫瑰還可以作為補充人體微量元素和膳食纖維的食物[10-11]。

隨著蔬菜、水果、種子和植物的根基不斷被開發(fā)利用，消費者開始將眼光投向了食用花卉[12]。在一些亞洲國家，花卉也成為了藥物和傳統(tǒng)食物。將花卉加入食物中，不僅可以改善食物的外觀，也能提高食物的營養(yǎng)價值[13-14]。玫瑰花在食品行業(yè)中可以用于制作果醬、果汁、醋、酒、奶油蛋糕和糖漿等[15-16]。玫瑰醬在發(fā)酵過程中，產(chǎn)生氨基酸、酚類和黃酮等風(fēng)味物質(zhì)，使得玫瑰醬不僅具有特殊的香味，也具有藥用和保健功效[17]。

微生物是玫瑰醬發(fā)酵的核心，能夠?qū)⒚倒寤ㄖ械囊恍I養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)因子[18]。經(jīng)過微生物發(fā)酵的玫瑰通常都具有微生物功能特性，從而提高食物本身的營養(yǎng)價值[19]。微生物群落結(jié)構(gòu)在玫瑰醬發(fā)酵過程中有著至關(guān)重要的作用，對玫瑰醬的產(chǎn)品質(zhì)量和口感均會產(chǎn)生明顯影響。目前關(guān)于玫瑰醬中微生物的種類研究較少，玫瑰醬中的微生物群落結(jié)構(gòu)也尚不清晰。所以，本研究基于此，對玫瑰醬中的微生物群落和結(jié)構(gòu)進行了研究。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料

選取3個國內(nèi)較為傳統(tǒng)的玫瑰醬產(chǎn)區(qū)，a1，a2為云南大理，a3，a4為山東平陰，a5為貴州貴陽。所有的樣品在2020年采集，每個樣品被平均分成4份，均保存在-21 ℃的冰箱中。

1.2 儀器和設(shè)備

高速離心機、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、PCR儀 上海儀器科技有限公司；電泳儀、1 000 mL移液槍、恒溫水浴鍋 杭州旌斐儀器科技有限公司。

1.3 玫瑰醬制作工藝流程

1.3.1 工藝流程

烘干的玫瑰花→加入蒸餾水復(fù)原→加入檸檬水→打漿→調(diào)配→熬制→裝罐→密封→殺菌→冷卻→成品。

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 原材料選擇

選擇花瓣飽滿、色澤鮮艷、香氣濃郁的玫瑰花。將外層變黃的花瓣、花蕊和花萼去除之后用清水洗凈備用。

1.3.2.2 復(fù)原

原材料整理結(jié)束之后，按料液比例為1∶4加入蒸餾水，在45 ℃的條件下加熱使干玫瑰花復(fù)原20 min，冷卻至室溫，加入一定比例的檸檬水，混勻，調(diào)節(jié)溶液的pH為5.0。

1.3.2.3 打漿

用磨碎機將配好的玫瑰花瓣打漿處理，磨碎之后再使用膠體磨對原料進一步處理，使玫瑰花漿均勻細膩。

1.3.2.4 調(diào)配

將玫瑰花醬、甲基纖維素鈉和瓊脂混合均勻，用小火熬制，不斷攪拌，攪拌期間不斷加入蔗糖溶液，一直熬至玫瑰醬中40%為固形物，之后裝罐密封。

1.3.2.5 殺菌

裝罐密封之后，將玫瑰醬放入滅菌鍋中，在100 ℃條件下加熱5 min，之后將玫瑰醬取出，在自然條件下冷卻，即制成玫瑰醬成品。

1.4 試驗方法

1.4.1 玫瑰醬中微生物DNA的提取

采用宏基因組DNA試劑盒從玫瑰醬中提取1 mL樣品，之后用濃度1%的瓊脂糖凝膠，在電泳儀上對DNA質(zhì)量進行測定。

1.4.2 PCR擴增與高通量測序

以提取的DNA作為模板，用引物341F和引物805R擴增DNA中的細菌，PCR條件：94 ℃預(yù)熱4 min，94 ℃變性30 s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸10 min。采用真菌的正向引物ITS1和反向引物ITS4擴增，PCR條件：94 ℃預(yù)熱4 min，94 ℃變性30 s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司測序完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 玫瑰醬中微生物多樣性分析

為了研究玫瑰醬中微生物的多樣性，把玫瑰醬中進行宏基因組分析所獲得的序列按照99%的相似性進行OTU分類，對玫瑰醬中微生物進行篩選之后，發(fā)現(xiàn)玫瑰醬中的細菌序列為32 122～120 312，一共有1 657個OTU，玫瑰醬中一共有真菌序列34 122～110 021，一共有2 109個OTU。

圖1中A和B為玫瑰醬中的微生物稀疏性分析，5種發(fā)酵的玫瑰醬中真菌和細菌的稀疏性都比較平坦，結(jié)果表明，玫瑰醬中宏基因組測序數(shù)據(jù)較為合理。

圖1 玫瑰醬中細菌稀疏性曲線(A)和真菌稀疏性曲線(B)Fig.1 Bacterial sparsity curve (A) and fungal sparsity curve (B) in rose sauce

玫瑰醬中的微生物多樣性用Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)進行分析，表示真菌和細菌在玫瑰醬中的多樣性和豐富度見表1和表2。

表1 細菌在玫瑰醬中的操作分類學(xué)單元(OTUs)Table 1 Operational taxonomic units (OTUs) of bacteria in rose sauce

表2 真菌在玫瑰醬中的操作分類學(xué)單元(OTUs)Table 2 Operational taxonomic units (OTUs) of fungi in rose sauce

由表1可知，樣本a2的ACE指數(shù)和Chaol指數(shù)相比于其他樣本較高，分別為1 623.167和391.19，說明a2玫瑰醬樣本中的細菌豐富度較高。在表2中，a1樣本的ACE指數(shù)和Chaol指數(shù)比其他樣本高，表明a1中的真菌多樣性比其他樣本高。

在表1中，a4樣本的Simpson指數(shù)最低，為0.27，Shannon指數(shù)最高，為7.124，表明a4是玫瑰醬樣本中細菌多樣性最高的。在表2中，a2樣本的Simpson指數(shù)最低，Shannon指數(shù)最高，分別為0.18和2.867，表明a2樣本中真菌的多樣性最高。

2.2 玫瑰醬中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

采用宏基因組對玫瑰醬中細菌多樣性進行分析，玫瑰醬在門和屬水平上的細菌多樣性見圖2，只有相對豐度值大于0.01%的細菌群落被展示在圖2中。

圖2 細菌群落在玫瑰醬中門(A)和屬(B)水平上相對豐度基于99%的序列相似性Fig.2 Relative abundance of bacterial communities of rose sauce at the phylum (A) and genus (B) levels based on 99% sequence similarity

由圖2中A可知，在自然發(fā)酵的5種玫瑰醬中，一共有31個門的細菌被檢測出來，其中變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門3個菌門為優(yōu)勢菌。在5個不同的樣本中，細菌優(yōu)勢群落存在一定的差異，a3樣本中擬桿菌門的細菌明顯多于其他4個樣本，變形菌門的微生物量明顯少于其他4個樣本。先前的一些研究結(jié)果也表明[19]，發(fā)酵食品中優(yōu)勢細菌主要為變形菌門和擬桿菌門，這些結(jié)論與我們的研究結(jié)果也相近。

由圖2中B可知，在屬水平上，5種發(fā)酵產(chǎn)品中的假單胞屬、泛菌屬、羅森伯氏菌屬、伯克氏菌屬和勞爾氏菌屬是明顯的優(yōu)勢屬，但是不同的樣本中，優(yōu)勢屬所占的比例有所差異。在5個樣本中，假單胞屬相比于其他菌群明顯占有優(yōu)勢。這主要是由于玫瑰醬在發(fā)酵過程中，不同樣本的發(fā)酵環(huán)境存在一定差異。

采用現(xiàn)代分類學(xué)，對玫瑰醬中的真菌多樣性進行分析，結(jié)果表明，玫瑰醬中的真菌一共有10個門，38個綱，79個目，130個科和319個屬。由圖3可知，5個樣本的玫瑰醬中，優(yōu)勢的真菌門為擔(dān)子菌門、子囊菌門和其他未分類的真菌。在a5樣品中，樣品中的真菌基本都為擔(dān)子菌類，a1樣品中其他未分類的真菌所占的比例相對于其他類型較大。

圖3 真菌群落在玫瑰醬中門(A)和屬(B)水平上相對豐度基于99%的序列相似性Fig.3 Relative abundance of fungal communities of rose sauce at the phylum (A) and genus (B) levels based on 99% sequence similarity

從屬水平可以看出，5種玫瑰醬中，最多的是酵母菌屬，其次是葡萄菌屬和間座殼屬。雖然不同的樣本中，真菌在屬水平上存在一定的差異，但是不同樣本屬多樣性存在的差異并不明顯。研究人員采用高通量測序?qū)Χ拱赆u中微生物多樣性進行研究，研究結(jié)果表明，豆瓣醬中結(jié)合菌門、擔(dān)子菌門和子囊菌門是優(yōu)勢真菌門，而屬水平上的曲霉屬和酵母菌屬是郫縣豆瓣醬的優(yōu)勢屬。與真菌多樣性相比，玫瑰醬中的細菌多樣性更加均勻，從5種玫瑰醬中，可以得出，不同的玫瑰醬中存在的真菌和細菌具有一定差異，此外，我們的研究結(jié)果表明，玫瑰醬中也包含一些分類地位尚不清晰的物種。

3 小結(jié)

玫瑰醬的生產(chǎn)一般情況是在開放環(huán)境中進行的，在加工過程中不需要殺菌，所以玫瑰醬中微生物種類豐富。我國的玫瑰醬產(chǎn)地眾多，但是玫瑰醬的生產(chǎn)沒有統(tǒng)一的標準，導(dǎo)致不同的區(qū)域，甚至同一區(qū)域不同的生產(chǎn)時間，玫瑰醬的口感、風(fēng)味和品質(zhì)存在較大的差異[20]。另外，玫瑰醬中由微生物病原體造成的污染而引起的安全問題被社會廣泛關(guān)注。

采用宏基因組的方法，對5種玫瑰醬中的微生物多樣性進行研究和分析，研究結(jié)果表明，玫瑰醬中優(yōu)勢的細菌菌門包括變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，優(yōu)勢的細菌屬包括假單胞屬、泛菌屬、羅森伯氏菌屬、伯克氏菌屬和勞爾氏菌屬；優(yōu)勢的真菌門包括擔(dān)子菌門、子囊菌門，優(yōu)勢的真菌屬包括酵母菌屬，其次是葡萄菌屬和間座殼屬。