CRISPR/Cas9技術在遺傳性心臟疾病中的研究進展

黎江溪，張世梅，王玉鑫，趙躍

（ 大理大學基礎醫學院 生理學與病理生理學教研室，云南 大理 671000 ）

自人類基因組成功測序以來，基因編輯技術的問世為解析生物體的基因信息和功能提供了巨大的便利。常見的基因編輯技術有三種：其中最早的是鋅指核酸酶（zinc finger nucleases, ZFNs）技術，由ZFN二聚體通過DNA結合域（鋅指結構域）識別雙鏈DNA上的靶位點，及FokI（核酸內切酶結構域）行使切割功能［1］。另一種是轉錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator like effector nucleases, TALENs）技術，該技術的工作原理與ZFNs類似。而規律成簇的間隔短回文重復序列（clustered regularly inter spaced short palindromic repeats, CRISPR/Cas9）是最新發現的。CRISPR/Cas9系統與ZFNs、TALENs相比有著操作簡單、識別位點多樣化、成功率高、花費低、周期短、毒性低等優點。這三種基因組編輯工具都可以切割DNA雙鏈，作為進一步探索疾病病理生理學的理想工具而廣泛用于生命科學各個領域［2］。

在心臟病學領域，與已知基因相關的疾病已得到充分研究。心臟病變常表現出一系列的心電功能障礙，患者最終可能出現進行性心力衰竭或心臟性死亡。在所有年齡段，遺傳性心臟病都是與人類疾病相關發病率和死亡率的主要原因，且病變除心臟移植手術外無其它徹底治療方法，這給全球造成嚴重的經濟負擔。一直以來，人們缺乏相對可靠的心臟疾病模型［3］，如今，在CRISPR/Cas9技術偶聯下，針對相應的遺傳性心臟病的體內外模型相繼問世。此外，對于遺傳性疾病，CRISPR/Cas9在基于分子的干預領域（如抑制DNA或DNA上的遺傳缺陷表達）取得了巨大的成功，在RNA水平也衍生了成熟的療法，如基因組編輯、外顯子跳躍、等位基因特異性沉默、RNA轉拼、基因替代療法等。因而，CRISPR/Cas9技術將引領人們對遺傳性心臟病的探索走向新未來。

1 CRISPR/Cas9基因技術

根據核酸內切酶的識別和切割機制分類，CRISPR/Cas9系統為IIA型系統［4］，組成最為簡單，且準確、快捷、高效、成本低，最受人們矚目。

1.1 CRISPR/Cas9的發現

CRISPR/Cas系統是存在于多數古生菌和細菌中的獲得性免疫系統。最早于1987年，日本科學家ISHINO等［5］在大腸桿菌中首次發現串聯間隔重復序列。2002年，JANSEN等［6］正式將其命明為CRISPR，還以Cas來命名相關的核酸酶。2005年MOJICA和POURCEL等［7-8］發現CRISPR的間隔序列（spacer）和宿主菌的染色體之外的遺傳物質高度同源，并猜測其對外源遺傳物質有免疫作用。之后，MAKAROVA等［9］猜想CRISPR/Cas系統可能是細菌的適應性防御系統。2007年，研究人員證明了嗜熱鏈球菌中的CRISPR/Cas系統是針對溶血性噬菌體的適應性免疫系統，推測Cas9可能是干擾所需的唯一蛋白質［10］。2008年，科研人員在表皮葡萄球菌和大腸桿菌中發現成熟的CRISPR RNAs（crRNAs）可以與Cas9蛋白形成復合體，該復合體能干擾噬菌體的增殖，為CRISPR/Cas9技術的發展奠定了基礎［11］。2012年，有研究表明tracrRNA對于Cas9核酸酶復合物具有重要功能，且由crRNA和tracrRNA融合成的sgRNA依舊會介導Cas9復合體發揮功能［12］。2013年，張峰等［13］建立了由CRISPR、tracrRNA和Cas9組成的基因調控系統，首次建立了小鼠疾病模型。2016年，SUZUKI等［14］通過CRISPR技術將DNA片段插入非分裂細胞中，在細胞治療等方面引起巨大反響。2020年10月，諾貝爾化學獎被授予共同開發CRISPR基因編輯工具的法國微生物學家Emmanuelle和美國生物化學家Jennifer。短短30余年，CRISPR系統在生命科學的各個領域都得到了迅猛發展，其中CRISPR/Cas9系統被人們認為是改造得最成功的基因編輯工具。

1.2 CRISPR/Cas9的組成及原理機制

CRISPR/Cas9系統主要由三部分組成，短RNA分子、指導RNA（gRNA）及有核酸酶活性的Cas9蛋白組成的核糖核蛋白復合物［15］（見圖1）。規范的CRISPR/Cas9系統充當位點特異性核酸酶，對由gRNA決定的底物DNA序列進行靶向。在CRISPR/Cas9中，指定DNA靶標的部分不是蛋白質本身，而是單向導RNA（sgRNA）分子，能夠直接設計和合成大?。?6］。Cas9蛋白的使用避免了其他DNA結合蛋白［例如鋅指核酸酶（ZFNs）和轉錄激活因子樣效應物（TALE）］每次都需要根據不同的靶DNA序列的需求重新設計的弊端。sgRNA Cas9的切割需要sgRNA（間隔序列）和protospacer（靶DNA序列）之間的序列互補，以及在其3'端存在合適的原間隔子序列（PAM），即CRISPR/Cas9的識別依賴于crRNA或sgRNA上的20個堿基的向導序列與目的DNA以及PAM切割位點的特異性［17］（見圖2）。CRISPR/Cas9系統源自原核生物中適應性免疫系統，PAM序列的存在使該系統能夠區分自身和非自身的DNA靶標［18］。當外源性遺傳物質入侵時，該系統的蛋白-RNA復合物首先與引導RNA的堿基配對定位在目標DNA序列上，然后在RNA指定的基因座上產生天然的dsDNA斷裂（DSB）。為了響應DSB，細胞DNA修復則會通過非同源末端連接（NHEJ）致使DNA切割位點的隨機插入或缺失。若存在同源DNA模板，切割位點周圍的DNA就可以通過同源指導修復（HDR）來替換。在此過程中，HDR與NHEJ相互競爭，而插入缺失標記比基因置換更為豐富［19］?？蒲腥藛T在使用CRISPR/Cas9時通常首先設計一小段特異性RNA序列（single guide RNA,sgRNA）與Cas9和轉錄調控因子形成的融合蛋白組成復合體，然后使復合體中的sgRNA的堿基互補配對序列與目的基因結合，之后Cas9 sgRNA復合物作為支架將效應分子募集到相應靶標從而激活基因轉錄或因空間位阻阻止RNA聚合酶與啟動子結合及抑制轉錄延伸，最終Cas9利用內切酶活性對目標DNA序列進行切割［20］。

圖1 CRISPR/Cas9系統的組成成分

圖2 CRISPR/Cas9系統的識別原理

1.3 CRISPR/Cas9的局限及改進方法

CRISPR/Cas9作為高效的基因編輯技術，存在著一些尚待解決的問題，如備受關注的脫靶效應、遞送系統等，如何提高基因編輯的準確率及效率仍是科研人員關注的話題。

1.3.1 CRISPR/Cas9的局限 ①CRISPR/Cas9的脫靶效應CRISPR/Cas9進行基因組編輯會產生DSB，從而引起易錯的非同源末端連接DNA修復途徑，導致脫靶。脫靶效應可分為三種類型［21-22］，第一種包括其他PAM（5'-NGG-3'）上具有取代或錯配的區域；第二種涉及其他PAM上包含插入和/或缺失的區域；第三種是切割具有不同PAM位點的序列。目前已有多種防止脫靶斷裂的方法，包括雙切口法，FokI-dCas9融合蛋白法和截短sgRNA法等［23］。②CRISPR/Ca9切割位點的偏移和低精確修復比例CRISPR/Ca9系統進行精確編輯時，會引入一段外源DNA進行同源修復，但由于Cas9蛋白切割位點可能會產生偏移，且修復系統外源與DNA同源修復缺乏響應，使得精確修復比例變低［24］。sgRNA的長度和靶標的位置也會對CRISPR/Ca9系統的精確性產生影響［25］。③PAM序列的嚴格依賴性Cas9蛋白與PAM結合對靶標序列進行識別時，一定程度上PAM可以限制CRISPR/Ca9系統對靶點的選擇。PAM的有限性導致CRISPR/Ca9系統不能在全基因組的任意位點進行特異性切割［26］。④傳遞系統中的載體問題CRISPR/Ca9系統的運輸主要是物理遞送及病毒遞送。物理遞送包括顯微注射、電穿孔等，常面臨遞送容量、藥理問題等［26］。病毒載體則可能引發插入誘變、免疫原性及致癌作用等相關問題。其中，腺相關病毒（AAV）是CRISPR/Cas9組件遞送的常用的選擇，但AAV能容納的貨物體積較小［27］。⑤Cas9蛋白導致的宿主細胞的免疫排斥反應CRISPR/Ca9系統能引發靶細胞免疫排斥反應，當成分在體內傳遞，宿主的免疫系統便會發生排斥［28］。與其它病毒相比，AAV的免疫原性差，能觸發免疫系統的各個組成部分。此外大多數人已經接觸過腺病毒，會導致預先存在的適應性反應，這使得免疫排斥反應更為復雜［29］。

1.3.2 CRISPR/Cas9的改進方法 ①sgRNA的設計sgRNA與靶基因特異性結合，對于Cas9執行靶向切割功能的效率有較大影響。對于sgRNA，取決于物種基因組的大小，可能存在較多相似的序列，這些相似的序列斷裂可能導致惡性腫瘤甚至死亡［30］。有關CRISPR/Cas9初步靶向的研究表明，并非gRNA中的每個核苷酸堿基都需要與靶DNA序列互補才能影響Cas9核酸酶活性。目前人們通常將crRNA和tracrRNA結合成一條單獨sgRNA，在早期，執行引導功能的RNA是雙引導RNA（dual guide RNA），其中crRNA和tracrRNA分別各自表達［31］。但 sgRNA與 Cas9形成的 Cas9-sgRNA復合物比雙引導RNA與Cas9形成的Cas9-crRNA-tracrRNA復合物速度更快，使得用sgRNA進行基因編輯時效率會更高。②CRISPR/Ca9運載體的選取安全高效的運輸載體也是CRISPR/Ca9有效應用的重要部分。將攜帶的DNA序列傳遞到靶細胞時可采用非病毒技術，例如電穿孔，脂轉染和顯微注射［32］。顯微注射進行的基因轉移被看作是金標準，傳遞效率約為100%［33］。該方法的優點是效率高及對傳遞大小的限制小，缺點是只能在體外或離體貨物中使用。近年來，科研人員測試了基于納米粒子的創新傳輸系統，該系統能提供CRISPR/Cas9構建體且最大限度地發揮相應功效［34-35］。③CRISPR/Cas9基因靶向效率在HDR修復過程中需質粒或單鏈寡核苷酸作為修復過程中的模板。目前HDR模板能夠被病毒或非病毒載體安全地運送到細胞核［36］。有研究表明［37］，HDR 模板末端添加的截短的Cas9目標序列（tCTS）與Cas9核糖核蛋白（RNP）相互作用，可使模板快速穿梭至細胞核，HDR效率提高約2～4倍。此外，用聚谷氨酸將Cas9 RNP穩定納米顆粒，編輯效率提高約兩倍且毒性小能凍干保存。結合這兩種改進，即使減少HDR模板劑量，也能提高基因靶向效率。

2 CRISPR/Cas9在遺傳性心臟病中的應用

大多數遺傳性心臟疾病，如：冠心病（CHD）、肥厚型心肌?。℉CM）、杜氏肌營養不良（DMD），由單個基因或多個突變基因引發，某些神經肌肉疾病也具有心臟疾病的特征［38-39］。盡管這些疾病具有很大的異質性，但許多研究小組已成功鑒定出與心臟病相關的基因，這些信息能被基因組編輯技術所利用。CRISPR/Cas9技術相比其它兩種編輯技術有著突出的優點，廣泛用于基因的敲除或敲入標記、大片段刪除及轉錄調控，常作為探索與遺傳性心臟疾病機制及治療的重要工具。

2.1 體內外模型中的應用

2.1.1 體外模型 人類胚胎干細胞（hESC）的出現和適當的培養使它們成為研究特殊疾病和機制的有效工具，CRISPR/Cas9技術可以實現等基因集的生成，在比較疾病相關和健康的同基因hPSCCM的集合時，將突變對心臟疾病進展的影響分離［40］。在CRISPR/Cas9技術幫助下，針對遺傳心臟疾病的優秀模型相繼問世。JAFFRé等［41］對患者來源的心肌細胞運用CRISPR/Cas9產生的等基因對照iPSC來源的心肌細胞成功建立Noonan綜合征的HCM模型。LI等［42］使用CRISPR/Cas9技術敲除H9（hESC）細胞系上的MLP（橫紋肌相關蛋白）產生相應的缺陷型，該缺陷型后發展為HCM。Roche等［43］利用 CRISPR/Cas9 在人類誘導的hiPSC-CMs引入了Brugada綜合征（BrS）突變，作為一種獨立于患者的遺傳背景，揭示了鈉通道失活引發BrS的機制。

此外，CRISPR/Cas9技術常用于研究各種基因或蛋白質在遺傳性心臟疾病機制中的作用。CHANG等［44］利用CRISPR/Cas9技術構建了兩種FHL2基因敲除胚胎干細胞系，可用于DCM的機制研究及藥物篩選。CEHOLSKI等［45］通過構建PLN突變hiPSC-CM細胞系，證實了該突變可導致心肌細胞對β受體激動劑反應遲緩。LI等［46］使用CRISPR/Cas9技術創建RAD（糖尿病相關蛋白）缺陷型人類胚胎干細胞系證明了細胞內鈣水平升高和鈣調節異常是RAD缺乏導致心臟肥大的核心機制。XIE等［47］利用CRISPR/Cas9基因編輯技術產生了有關TOF（法洛四聯癥）的hESC，揭示了TOF罕見突變通過HB-EGF信號轉導人胚胎干細胞衍生的心肌肥大。ANG等［48］將 iPSC和CRISPR/Cas9技術相結合，在體外建立了與GATA4基因突變相關的先天性心臟病模型，來探討該基因突變所導致的發病機制。MARCZENKE［49］利用 CRISPR/Cas9 與房顫相關的KCNA5基因，首次闡明了K+離子通道在心房hiPSC心肌細胞中的作用。

不僅如此，CRISPR/Cas9技術也增進人們對遺傳性心臟病病理生理的理解。BHAGWAN等［50］利用CRISPR/Cas9切口酶靶向hiPSC中的基因座且引入遺傳編碼的鈣指示劑，使得hPSC-CMs能夠進行實時 Ca2+成像。CEHOLSKI等［51］用 CRISPR/Cas9將R9C PLN（引起DCM的心臟蛋白）突變的內源位點插入沒有心血管疾病的人誘導hiPSC系，顯示出鈍化的β激動劑反應和有缺陷的鈣處理，助于更好地了解人類心肌細胞中遺傳性DCM的病理特征。SMITH等［52］利用CRISPR/Cas9技術在誘導的hPSC上引入某種突變產生了概括了許多疾病表型（異常收縮、Ca2+敏感、心律失常和肥大信號）的心肌病模型。WANG等［53］使用患者來源的hiPSC，運用CRISPR/Cas9和組織工程技術，在組織構建體中復制了巴氏綜合征心肌病的病理生理學。GUO等［54］開發了基于CRISPR/Cas9-AAV9的體細胞誘變的CASAAV平臺，通過該平臺分析并解剖心肌細胞。

2.1.2 體內模型 由于衍生的心肌細胞應用上顯示出有限的成熟度且物種來源不同，導致hPSCCM疾病模型無法概括多細胞完整心臟系統的生理復雜性，例如，代謝變化及細胞外基質改變［55］。近年來一些研究將CRISPR/Cas9技術應用到動物疾病模型的構建中，避免了傳統的建模耗時長，效率低以及定位不精準等問題。其中，小鼠是最早且比較成熟的轉基因動物模型。NAKAMURA等［56］使用CRISPR/Cas9相關DNA的血管內遞送轉染小鼠胎兒細胞證明了小鼠胎兒心臟中基因組序列的突變確實是通過靜脈內導入并轉染胚胎心臟細胞并隨后表達Cas9和gRNA誘導的。JOHANSEN 等［57］使用 CRISPR/Cas9和 AAV9介導的短鏈RNA產生了心肌細胞特異性Cas9小鼠，并證明Cas9表達不影響心臟功能或基因表達。LIU等［58］利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術在小鼠中驗證了引發發育不良的左心綜合征（HLHS）的雙基因，表明HLHS可以通過組合方式遺傳產生，從而為冠心病的復雜遺傳學提供了新的范例。ALANKARAGE 等［59］通過創建 CRISPR/Cas9 基因編輯的小鼠模型對從患有先天性心臟?。–HD）的患者中鑒定出的新型錯義變異體進行功能分析，揭示了多個先天性異常對CHD的影響。

隨著基因編輯技術的不斷進步，CRISPR/Cas9產生了許多除小鼠以外的轉基因動物。CHEN等［60］使用CRISPR/Cas9系統生成的gtpbp3敲除斑馬魚，演示了gtpbp3敲除后異常的線粒體tRNA代謝，研究了Gtpbp3對線粒體生物發生和心臟功能的影響。LIANG等［61］通過CRISPR/Cas9技術在斑馬魚模型中進一步分析了異位癥候群（HS）候選基因的功能，揭示了可能具有不同分子機制的三個潛在的HS致病基因。SASAGAWA等［62］使用CRISPR/Cas9敲除了斑馬魚中的GSTK1，發現在GSTK1基因敲除的斑馬魚中GSTK1的下調可能是各種病因的HCM的共同機制。SUI等［63］則通過CRISPR/Cas9技術成功產生了有關DMD的兔模型。YU等［64］也利用CRISPR/Cas9技術成功產生DMD的豬模型。DENIZ等［65］將CRISPR/Cas9系統和微型成像模態光學相干斷層掃描相結合，對非洲爪蟾等發育系統強大的生物的心臟發育進行不同基因的分析。

2.2 基因治療中的應用

遺傳性心臟病采用基因治療可以實現永久糾正，該思想最早由Clyde Keeler于1947年提出［66］。目前，全球已批準2300多項基因編輯臨床試驗，這些臨床實驗主要針對遺傳性疾病。而下一代測序、生物信息學分析、臨床發現和基礎研究正在不斷發現與心臟疾病有關的新基因，也為基因組編輯提供了新的治療靶點。精確的基因組編輯技術使人類的種系突變得以糾正，盡管備受爭議，一項研究在CRISPR/Cas9基礎上將攜帶男性患者的雜合MYBPC3突變的精子，對健康女性的卵母細胞進行授精，發現攜帶HCM突變的人類胚胎中進行高保真基因修復是可行的，該技術還消除了鑲嵌現象［67］。PRONDZYNSKI等［68］評價 MYBPC3反式剪接和基因置換作為人iPSC衍生心肌細胞的治療選擇，報告了來自健康供體和攜帶MYBPC3截短突變的HCM患者在hiPSC-CM中使用HCM的兩種基因療法的主要可行性。

由于疾病的遺傳性和缺乏有效的療法，DMD是種系基因組編輯的有吸引力的候選疾病。BENGTSSON等［69］利用CRISPR/Cas9技術開發了多種方法來改善患有DMD的小鼠模型的病理生理，表明AAV介導的肌肉特異性基因編輯在DMD的治療中具有重要的潛力。MATA等［70］則通過CRISPR/Cas9技術矯正了DMD基因在狗疾病模型中的突變，并在該方法中提高了HDR介導的基因修復率。

不僅如此，一些不常見的遺傳性心臟疾病在治療中也成功應用了CRISPR/Cas9技術。KANEKO等［71］通過CRISPR/Cas9進行種系基因組編輯，以敲除嚴重心力衰竭小鼠模型中的PLN基因，結果表明被敲除的小鼠存活時間更長。XIE等［72］通過實驗表明體內CRISPR/Cas9基因組編輯是通過選擇性破壞致病突變來治療PRKAG2心臟綜合征和其他主要遺傳性心臟病的有效工具，且結合多種測序分析，在樣品的任何測試位點均未檢測到脫靶和插入缺失。ZENG等［73］為馬凡氏綜合征基因治療的技術可行性提供了原理證明，他們利用CRISPR/Cas9技術對人細胞和雜合子胚胎的堿基編輯實現了馬凡氏綜合征病原性FBN1突變的校正。

3 結語與展望

CRISPR/Cas9基因編輯技術可在細胞和生物個體水平中實現單個堿基的編輯，是最具有應用前景的基因編輯技術。盡管CRISPR/Cas9技術廣泛用于基因的敲除或敲入標記、大片段刪除及轉錄調控，成為了探索與遺傳性疾病病理機制的重要工具。但由于CRISPR/Cas9基因編輯技術還存在一些問題需要我們去解決，如脫靶效應能導致未敲除目的基因，反而破壞了其他基因，最終造成癌癥的發生及一些毒副作用。因此，CRISPR/Cas9技術在遺傳疾病領域的臨床應用還面臨一定的挑戰。但通過科學家的努力，CRISPR/Cas9技術正在不斷的被改進和優化，未來對遺傳性心臟疾病的機制研究及臨床治療中將得到廣泛的應用，最終攻克遺傳性心臟病的治療難題，為更多的遺傳性疾病患者帶來福音。