基膜結構蛋白在胚胎植入與早期胚胎發育中的作用研究進展*

鞠文涵，連方，趙帥，相珊

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250011）

良好的胚胎質量、子宮內膜容受性是妊娠成功的關鍵因素。目前，子宮內膜容受性已經成為不孕癥的熱點議題。胚胎植入涉及胚胎和母體子宮內膜組織互相作用，受到類固醇激素、生長因子和趨化因子等調節網絡的綜合作用。胚胎附著于子宮內膜上皮后，子宮內膜間質成纖維細胞就會完成蛻膜化的過程，蛻膜細胞分泌多種蛋白，類固醇激素以旁分泌或并列分泌的形式釋放于細胞外周，形成一個復雜的基質網絡，即細胞外基質[1]。其中基膜為細胞外基質中特化的網狀膜結構，由不同的蛋白纖維組成，可提供結構支持將細胞與外環境隔離，又與其外環境相連接。各個組織部位的基膜具有不同的生化特性與功能，基膜約含有60～200 種蛋白質，總體可分為結構性蛋白和調節性蛋白兩類。基膜結構蛋白是構成基膜的結構支架，主要由層粘連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白等組成，而調節蛋白則包括各種蛋白酶和生長因子[2-3]。基膜在胚胎植入過程中包繞胚胎組織，以往被認為是實現物質交換的半透膜，但越來越多的研究表明基膜亦參與調節細胞信號轉導以調節組織發育、功能和修復[4-5]。迄今為止，基膜調控胚胎植入和早期胚胎發育的作用機制尚未闡明，充分了解基膜的生物學機制，確定細胞外基質的作用，進而人為干預胚胎植入和胚胎早期發育，對提高子宮內膜容受性、改善妊娠結局具有重要意義。

1 基膜結構蛋白

基膜可被認為是多孔的彈性網絡，主要由膠原蛋白、層粘連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白等組成，這些蛋白與水相互作用以形成較為穩定的薄膜結構，起到支持和連接作用[6]，參與胚胎定位、黏著、穿入的生理過程，亦可調節胚胎植入深度與早期胚胎發育。

1.1 膠原蛋白

膠原蛋白是哺乳動物體內含量最多、分布最廣的功能性蛋白，是由Gly-X-Y 序列重復組成的三螺旋膠原結構。根據功能可分為成纖維膠原（如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅺ、Ⅶ型膠原）和非成纖維膠原[7]。膠原蛋白是構成基膜的網狀鋼架結構的基礎[5]。

1.2 層粘連蛋白

層粘連蛋白α、β 和γ 亞型自聚合形成異源三聚體，提供蛋白質結合位點，組裝其他細胞外基質蛋白，并與Ⅳ型膠原蛋白相互作用形成網狀結構，構成基膜的完整性[8]。胚胎附著后，層粘連蛋白通過表面受體與胚胎組織緊密結合、相互作用。有學者研究發現反復種植失敗人群中子宮內膜層粘連蛋白β3 亞基表達在預測替代周期移植妊娠結局時的敏感性為66.7%，特異性為80%，準確性為75%[9]。

1.3 蛋白聚糖

蛋白聚糖是由一條或多條糖胺聚糖鏈共價連接的核心蛋白組成的生物大分子，廣泛參與細胞黏附和遷移、信號傳導、生殖細胞發生等生物過程[10-12]，近年亦有學者表明其在胚胎心臟和神經組織發育、軟骨發生中發揮作用[13]。糖胺聚糖是不分支的長鏈高度硫酸化的多糖鏈，由一個重復的二糖單元組成。根據二糖單元的組成，蛋白聚糖可分為幾種類型[14]，包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan,HSPG）和硫酸軟骨素蛋白聚糖（chondrotin sulfate proteoglycan,CSPG）等。

1.4 巢蛋白

巢蛋白是一種糖蛋白，包含三個球狀結構域，主要由上皮細胞和間充質細胞表達，其特定結構域參與交聯膠原蛋白Ⅳ和層粘連蛋白，起到穩定基膜的作用[15]。近年來關于巢蛋白在胚胎植入中的研究較少，但相關研究表明其在早期胚胎發育過程中參與脂肪、血管、軟骨的生成與神經發生[16]。

總之，基膜中的膠原蛋白和層粘連蛋白組裝成網狀結構，構成基膜結構的穩定性，而蛋白聚糖、巢蛋白通過特定結構域連接到網狀結構上，以增加基膜結構的穩定性。基膜又通過這些結構蛋白起到結構支持、細胞信號傳導、保護屏障等功能，在胚胎植入和早期胚胎發育中發揮作用。

2 基膜及其結構蛋白在胚胎植入、胚胎早期發育中的作用

胚胎的滋養細胞首先穿透子宮上皮及基膜，然后再侵入子宮蛻膜基質。而在胚胎植入后，基膜一方面充當滲透膜參與物質交換，另一方面因其包繞胚胎組織，限制胚胎的早期發育，因此必須進行重塑和降解以配合胚胎植入與胚胎早期發育。

2.1 蛋白聚糖參與胚胎黏附侵襲

HSPG 亞型多配體蛋白聚糖（Syndecan-1,SDC1）參與子宮內膜趨化性和血管生成，胎兒生長受限母體血清的SDC1 明顯降低[17]。胚胎植入過程中，蛻膜細胞與早期滋養層細胞共培養實驗表明SDC1增強兩者間的相互作用[18]，間接表明SDC1 在胚胎植入過程中調節胚胎的入侵，是正常胚胎植入和成功妊娠的關鍵。CSPG 中的多功能蛋白聚糖（Versican）亞型，可結合透明質酸并形成大的細胞外基質聚集體，影響細胞增殖、黏附和遷移[19]。Versican 亞型表達受類固醇激素的調節，在分泌中期子宮內膜中的表達明顯上調，在體外實驗模擬胚胎植入時，Versican V1 型增強了絨毛膜癌細胞系（BeWo）球體對子宮內膜癌細胞系（Ishikawa）細胞單層的附著，而使用可降解硫酸軟骨素的軟骨素酶處理時此種效應消失[20]，提示Versican V1 型與胚胎黏附、入侵密切相關。由此可見，胚胎植入涉及胚胎和子宮內膜基質細胞表面成分表達的變化，蛋白聚糖Syndecan-1、Versican 參與影響和調節胚胎滋養層的侵襲，支持胚胎黏附、植入過程。

2.2 膠原蛋白降解以適應胚胎植入

特定類型的膠原蛋白在胚胎植入過程中具有不同的時空表達模式。在胚胎植入前，子宮內膜和蛻膜細胞中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型膠原蛋白均有表達，而胚胎植入期僅Ⅳ型膠原蛋白在蛻膜、基膜中積累。據報道，胚胎滋養層黏附性在Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白的存在下最高[21]。然而，Ⅰ、Ⅳ型膠原蛋白片段中的一些C 端的非成膠結構域（noncollagenous domain C1,NC1）卻可能具有抑制血管生成、細胞增殖和侵襲的能力[22]。胚胎組織滋養層產生的整合素αvβ3 能與Ⅳ型膠原蛋白的NC1 結合，介導胚胎黏附、入侵，此過程伴隨著膠原蛋白的降解，產生膠原蛋白片段反作用抑制滋養細胞的過度入侵[23-24]，使胚胎植入于適當的位置。由此可見，胚胎植入期間特定表達的膠原蛋白可能在促進滋養層侵襲中發揮作用，而隨著胚胎黏附降解產生的膠原蛋白片段可能發揮著抑制細胞黏附、增殖和侵襲的相反的作用，膠原蛋白和其碎片間的表達存在微妙的平衡關系，這有助于正常妊娠。

2.3 層粘連蛋白沉積參與調節胚胎極性

胚胎附著后基膜中不同蛋白在不同空間和時間定位和表達使得基膜重塑以協調早期胚胎發育過程。正常大小胚胎羊膜腔的形成需要基膜誘導的極化作用及胞吐作用實現[25]。有研究表明層粘連蛋白α5 在小鼠妊娠第5～8 天的蛻膜中高表達[26]。研究發現外胚層通過整合素α6β1 與層粘連蛋白511 相互作用，內胚層通過整合素α5β1 與纖連蛋白相互作用作為胚胎組織與基膜的緊密連接的主要粘合劑[27]。體外實驗發現層粘連蛋白111 選擇性地抑制內胚層形成并誘導外胚層上皮化，而將層粘連蛋白111 顯微注射到胚狀體內部則導致內部基膜具有完全相反的極性，以表明層粘連蛋白的組裝位點與胚胎上皮極性軸的建立有關[28]。研究表明層粘連蛋白γ1 鏈C 末端尾部的Glu 殘基（γ1C-Glu）突變雖然不影響層粘連蛋白三聚體和基膜的形成，但突變后其與整合素α3、α6 和α7 相互作用受阻，小鼠胚胎植入后發生變形，表現為頂葉卵黃囊的生長缺陷，最終導致胚胎死亡[29]。這提示層粘連蛋白是介導基膜組裝的物質，而且可能充當外胚層上皮的極性載體，誘導外胚層譜系分化，隨后將對胚胎發生過程產生影響。

2.4 基膜穿孔重塑參與形成早期胚胎發育極性

小鼠胚胎植入后早期呈現一個中空的圓柱形結構，外胚層沿著胚胎的近-遠軸生長，隨后外胚層和內臟內胚層之間的基膜的局部破裂誘導遠端內臟內胚層遷移到前側以建立前后軸[30]。基膜的重塑在此過程中發揮了重要作用。Nodal 為轉化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）家族中的一員。有研究表明在小鼠胚胎植入到原腸胚形成的發育過程，Nodal 信號傳導通過靶向Smad2 或Smad3調節基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）和MMP-14 的表達以使基膜穿孔均勻分布適應胚胎生長，隨后穿孔重新分布到胚胎后側，以滿足原腸胚形成過程中的原始條紋延伸[31]。這提示在胚胎植入早期Nodal 信號調節MMP 家族介導基膜穿孔的產生和動態分布，以助于胚胎植入，協調胚胎的生長和形態發生，以適應胚胎早期生長的需要，說明在早期胚胎發育過程中受時空調節的基膜重塑的重要性。

2.5 基膜緩沖機械壓力穩定早期胚胎發育形狀

基膜存在于上皮細胞和內皮細胞的基底側，在胚胎植入和發育時承受機械壓力是不可避免的。現有研究表明基膜比其覆蓋的細胞更硬，在組織變形時，大部分壓力由基膜承擔[6]。Reichert 膜是一種特異性基膜，其主要成分與基膜一致，由小鼠胚胎的壁側內胚層細胞合成。以往Reichert 膜被認為是胎盤形成前一種可滲透的母胚之間交流的液體空間，允許營養物質擴散。子宮內壓由子宮平滑肌收縮產生，在胚胎植入后顯示出高頻率的周期性峰值，作用于胚胎組織[32]。研究發現Reichert膜的存在創造相對密封的環境將胚胎與母體組織分開，提供一定空間保護胚胎形狀，緩沖子宮平滑肌收縮施加在胚胎上的宮內壓力，將胚胎穩定為早期發育所需的卵圓柱形，Reichert 膜缺陷小鼠胚胎出現畸形[33]。這提示正常基膜的分子滲透功能和機械穩定性對胚胎早期發育至關重要，基膜緩沖子宮平滑肌施加的機械壓力，使胚胎發育不喪失完整結構。

2.6 構成胚胎早期發育的微環境

有學者通過透射電子顯微鏡成像結合蛋白質測定發現胚胎附著后基膜中過氧化物酶在基質細胞周圍聚集，其抗菌機制可能有助于在胚胎植入和早期胚胎發育期間對微生物感染進行自然防御；蛻膜肺出血-腎炎抗原結合蛋白在膠原蛋白Ⅳ和層粘連蛋白沉積后表達，且與基膜增厚相關；過氧化物酶與膠原蛋白Ⅳ型共定位，這表明該酶可能增強膠原蛋白Ⅳ網絡，以支持子宮內膜中的上皮細胞中的信號轉導[34]。蛋白質組學分析結合超微結構研究揭示基膜在胚胎早期發育過程中不僅充當靜態支架，亦影響胚胎發育，對胚胎起保護作用，參與組織穩定性和功能，相信未來結合生物力學測試、體內衍生的細胞黏附測定等新技術能為基膜在胚胎發育中的作用提供更新的見解。

3 應用研究

3.1 基因治療

隨著科技的發展，基因治療技術和方法不斷突破，基因治療獨立于疾病機制并提供實際治療。N-脫乙酰基酶/N-硫酸基轉移酶（N-deacetylase/Nsulfotransferase,NDST）介導HSPG 的形成。研究表明[35]，小鼠種植窗口期子宮內膜的NDST 高表達，NDST 基因敲除后卵巢和輸卵管功能不受影響，但種植窗口期子宮內膜腺體管腔閉合缺陷及持續的上皮增殖導致子宮內膜分化障礙，印度刺猬因子（Indianhedgehog,IHH）信號缺失導致子宮蛻膜化失敗，均提示HSPG 在小鼠植入過程中的調節信號轉導中起重要作用。小鼠實驗發現microRNA-183 可以通過靶向抑制翻譯肝素結合EGF 樣生長因子和層粘連蛋白γ 的mRNA 來阻礙胚胎植入[36]。細胞系實驗表明microRNA-29c 過表達負調節翻譯Ⅳ型膠原蛋白的mRNA，顯著改變滋養層細胞黏附過程[37]。siRNA 干擾層粘連蛋白α5 表達后可抑制人體外蛻膜化，這提示在體內通過自殺基因、基因沉寂、基因編輯等技術靶向相關的基因可能有助于促進胚胎植入及早期發育[26]，但需要進一步研究以確定體內作用機制。

3.2 干預結構蛋白

3.2.1 MMP 有利于膠原蛋白降解已知膠原蛋白的降解主要與MMP 的表達和活性有關，MMP-2 和MMP-9 具有切割變性膠原蛋白和完整Ⅳ型膠原蛋白的能力。研究發現體外受精-胚胎移植卵巢高反應患者圍植入期MMP-2、MMP-9 顯著降低，金屬蛋白酶組織抑制劑1 （metalloproteinase inhibitor,TIMP1）、TIMP3 增加[38]，均可導致植入期增厚的膠原蛋白無法正常降解，胚胎穿透基膜入侵子宮蛻膜基質的過程受阻。學者將MMP-2、MMP-9 與小鼠胚胎共同移植至交配后2.5 d 的假孕子宮，測定膠原蛋白含量，表明MMP-9 處理后膠原蛋白的降解顯著促進了小鼠滋養層細胞的擴散和侵襲，提高了妊娠率[39]。有學者通過動物實驗發現原人參二醇可能通過作用于雌孕激素受體或單獨作用以改善子宮內膜異位癥模型小鼠的胚胎植入率、妊娠率，其中一個作用機制為提高子宮內膜MMP-2、MMP-9 表達，以利于膠原蛋白降解和基膜重塑[40]。由此可見MMP 降解膠原蛋白的作用，參與基膜的重塑以調節滋養層細胞的侵襲，作用于胚胎植入過程中，揭示其在生理妊娠時的潛在作用。

3.2.2 適量的透明質酸可能對胚胎植入有利透明質酸（Hyaluronic acid,HA）屬于糖胺聚糖的一種，可用于組裝蛋白聚糖。體外實驗表明HA 在胚胎發育過程中能夠促進人胚胎干細胞向中胚層和心臟譜系的分化[41]，促進肌源性祖細胞遷移和增殖[42]。研究表明HA 通過微調胚胎和子宮血管形態發生在胚胎植入中發揮作用，但HA 沉積亦可導致母胚屏障擴大、擴散距離增加，導致植入受損[43]。另有學者研究表明蛋白多糖Versican-HA 復合物是血管生成和原始造血的必要條件，在原腸胚形成時提供了富含血管生成因子的微生態系統[44]。一項系統評價表明在輔助生殖技術胚胎移植培養基中添加HA 作為黏附化合物可提高臨床妊娠率和活產率[45]，這提示胚胎植入和早期發育時適量的HA 是有利因素。由此，在胚胎移植介質中添加HA 作為黏附化合物可能起到改善胚胎黏附性、促進微血管生成的作用，干預基膜的結構蛋白可能有利于提高胚胎種植率、支持早期胚胎發育。

4 小結

綜上所述，基膜依賴多種蛋白組分在不同空間和時間定位和表達調控胚胎植入、胚胎早期發育。在小鼠模型、細胞系模擬胚胎植入的模型中，許多靶點均已驗證，但仍然需要大量的體內外試驗去了解基膜的細分結構，探索它們之間的相互作用網絡。這為人為重塑基膜結構從而提高種植窗的接受胚胎植入能力、支持早期胚胎發育提供了一種可能。相信隨著科學技術的發展，基膜能在提高子宮內膜容受性、改善妊娠結局方面發揮更大的作用。