食用菌發酵液對酸奶理化性質和營養成分的影響

馬學蘭 周連玉 巨家升 孫文娟 王龍瑞

(1.高原科學與可持續發展研究院，青海 西寧 810008；2.青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海 西寧 810008；3.青海師范大學生命科學學院，青海 西寧 810008)

黃綠蜜環菌(Armillarialuteo-virens)，又名黃蘑菇、皇菇，夏秋季生長在低溫、高海拔的蒿草草甸或草原上[1]。虎掌菌[Tremellodongelatinosum(Scop.)Pers.]，又名獐子菌、仲帽，因其外觀獨特，酷似虎掌因而得名[2]，多分布于中國西藏、青海等西部高山高寒地區的森林中[3]。野生黃綠蜜環菌和虎掌菌子實體中含有較豐富的蛋白質、氨基酸、維生素、糖類等營養成分，具有豐富的營養價值和經濟價值[4-5]。目前黃綠蜜環菌和虎掌菌人工栽培技術難度大[2-4]，因此多數研究者[6-8]采用液體發酵技術得到其菌絲體或胞內外代謝產物。

酸奶是一種富含益生菌的健康飲食，由牛奶經乳酸菌發酵制成，含蛋白質、維生素A和B、鈣和錳等營養物質。研究[9]發現，添加食用菌發酵液可以提高酸奶中氨基酸等營養成分含量，賦予酸奶特殊的風味。目前，以黃綠蜜環菌或虎掌菌發酵液作為原料應用于乳制品的研究尚未見報道。

許多食用菌對硒具有很好的富集作用，在培養體系中能將無機硒轉化為有機硒[10-11]。研究擬在牛奶中添加虎掌菌或黃綠蜜環菌富硒發酵液，接入單一菌或混合菌發酵后，探討不同添加量的發酵液和不同乳酸菌對酸奶中感官指標、pH值、酸度、持水力、蛋白質、脂肪及礦質元素的影響，以期為未來營養強化型乳制品研制提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

嗜熱乳鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、虎掌菌[Tremellodongelatinosum(Scop.)Pers.]菌種、黃綠蜜環菌(Armillarialuteo-virens)菌種：青海師范大學實驗室；

托倫寶純牛奶：青海小西牛生物乳業股份有限公司；

葡萄糖：分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；

蔗糖：分析純，天津市河東區紅巖試劑廠；

氫氧化鈉、磷酸：分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；

亞硒酸鈉：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

四苯硼鈉：分析純，上海邁坤化工有限公司；

鉬酸銨：分析純，天津市津北精細化工有限公司。

1.1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LS-35SD型，江陰濱江醫療設備有限公司；

臺式低速離心機：TD5A型，湖南赫西儀器裝備有限公司；

生化培養箱：250B型，金壇市富華儀器有限公司；

紫外分光光度計：V-5100型，金壇市富華儀器有限公司；

超凈工作臺：CJ-1S型，天津市泰斯特儀器有限公司；

水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，金壇市天競實驗儀器廠；

微波消解儀：MD20H型，APL奧普樂儀器有限公司。

1.1.3 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL；

PDB培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL；

黃綠蜜環菌發酵培養基：KH2PO41 g、蔗糖40 g、MgSO41 g、牛肉膏1 g、Na2SeO30.14 g、蒸餾水1 000 mL[12]；

虎掌菌發酵培養基：葡萄糖60 g、酵母浸膏30 g、KH2PO41 g、Na2SeO30.10 g、蒸餾水1 000 mL[13]。

1.2 方法

1.2.1 黃綠蜜環菌和虎掌菌富硒發酵液制備

(1)虎掌菌富硒發酵液：根據文獻[13]制備，其總硒質量濃度為(1.43±0.03)mg/L，可溶性蛋白質量濃度為(30.41±0.78)μg/mL，氨態氮質量濃度為(0.39±0.02)mg/mL，還原糖質量濃度為(5.27±0.09)mg/mL，pH(5.20±0.10)。

(2)黃綠蜜環菌富硒發酵液：根據文獻[12]制備，其總硒質量濃度為(11.50±0.78)mg/L，可溶性蛋白質量濃度為(26.35±0.63)μg/mL，氨態氮質量濃度為(0.26±0.01)mg/mL，還原糖質量濃度為(48.39±0.76)mg/mL，pH(5.16±0.15)。

1.2.2 酸奶制作

(1)發酵劑制作：15 mL牛奶分裝于100 mL廣口瓶中，于115 ℃滅菌15 min，冷卻后接入1 mL副干酪乳桿菌或接入嗜熱乳鏈球菌和保加利亞乳桿菌各0.5 mL，40 ℃ 下培養至牛奶凝結[12]，得單一發酵劑或混合發酵劑，4 ℃冰箱中保存。

(2)富硒酸奶制作：在牛奶中加入6 g/100 mL的蔗糖，加熱濃縮至一定體積后，于115 ℃中滅菌15 min，虎掌菌發酵液或黃綠蜜環菌發酵液3 000 r/min離心10 min，上清液經0.45 μm無菌濾膜除菌后，分別以0(對照)，5，10，15，20，25，30 mL/100 mL的添加量加入到預處理后的牛奶中，接入3 mL/100 mL單一發酵劑或混合發酵劑混勻，最終每瓶牛奶體積為20 mL，每個處理5瓶，置于42 ℃培養箱中培養8 h，將凝固后的酸奶置于冰箱冷藏24 h，用于理化性質和營養成分測定。

1.2.3 酸奶理化指標測定

(1)感官指標：參照謝海軍等[14]的方法和GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》標準進行綜合評價。

(2)pH值：用酸度計測定。

(3)酸度：按GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》中的酚酞指示劑法執行。

(4)持水力：離心稱重法[15]。

1.2.4 酸奶營養成分測定

(1)可溶性蛋白：考馬斯亮蘭G-250染料法[16]。

(2)脂肪：按GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中的堿水解法執行。

(3)微量元素：酸奶經微波消解儀消解(工作參數見表1)后，分別采用GB 5009.87—2016《食品安全國家標準 食品中磷的測定》中的鉬藍比色法測定磷的含量、四苯硼鈉法[17]、偶氮氯膦III法[18]、鄰菲羅啉比色法[19]測定其鉀、鈣、鐵含量。

表1 微波消解儀工作參數

1.3 統計分析

試驗數據結果均采用平均值±標準差表示，各項指標釆用SPSS 16.0統計分析軟件進行單因素方差分析(LSD，P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 對酸奶感官評分的影響

由圖1可知，隨著黃綠蜜環菌或虎掌菌發酵液添加量的增加，酸奶的感官評分(口感、風味和組織狀態)逐漸降低。2種食用菌發酵液添加量為5～10 mL/100 mL時，單一菌或混合菌酸奶感官品質與對照組無顯著差異(P>0.05)；但添加量高于10 mL/100 mL時，酸奶感官品質(口感、風味和組織狀態)顯著低于對照組(P<0.05)，與其他菌發酵液的效果有差異，30 mL/100 mL蛹蟲草菌絲發酵液[20]、25 mL/100 mL紅汁乳菇菌絲體發酵液[21]、20 mL/100 mL白雞腿蘑發酵液[22]添加到牛奶中研制出的酸奶感官品質較好，可能與試驗所使用的食用菌種類、發酵原料及發酵條件不同有關。由此可知，不同食用菌發酵液在一定用量下能夠改善酸奶口感、風味和組織狀態，但超過一定量時會影響酸奶凝乳狀態和感官品質，可能是發酵液中過量的多糖與酸奶中的其他成分相互作用產生顆粒，使其口感變差[23-24]。

大寫字母不同表示接入混合菌的酸奶之間差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示接入單一菌的酸奶之間差異顯著(P<0.05)

2.2 對酸奶pH值的影響

由圖2可知，當黃綠蜜環菌或虎掌菌發酵液添加量增加時，黃綠蜜環菌混合菌酸奶pH值逐漸增大、單一菌酸奶pH值降低，虎掌菌混合菌酸奶和單一菌酸奶pH值均減小。當黃綠蜜環菌發酵液添加量為10～30 mL/100 mL時，與對照組相比，混合菌酸奶pH值顯著增大，單一菌酸奶pH值顯著減小(P<0.05)，且混合菌酸奶pH值比單一菌酸奶高10%以上。添加虎掌菌發酵液后制得的單一菌酸奶與混合菌酸奶pH值變化不大。虎掌菌發酵液添加量為5 mL/100 mL時，單一菌酸奶pH值相比于對照組無顯著性差異(P>0.05)，5～20 mL/100 mL發酵液時混合菌酸奶pH值較對照組無顯著差異(P>0.05)。

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2.3 對酸奶滴定酸度的影響

由圖3可知，隨發酵液添加量增加，黃綠蜜環菌發酵液的單一菌和混合菌酸奶酸度逐漸增加，而虎掌菌單一菌酸奶酸度先增加后降低、混合菌酸奶酸度逐漸增加。不同添加量的黃綠蜜環菌發酵液單一菌酸奶酸度顯著高于對照組(P<0.05)，虎掌菌發酵液除5 mL/100 mL外其他添加量單一菌酸奶酸度顯著高于對照組(P<0.05)，滴定酸度均超過110 °T；混合菌發酵劑發酵酸奶時，5～20 mL/100 mL 添加量對酸奶的影響較小，除30 mL/100 mL黃綠蜜環菌發酵液外，其余添加量的酸奶滴定酸度均在70～100 °T。有研究表明，40 mL/100 mL猴頭菇發酵液能夠提高混合菌酸奶酸度且降低pH值[25]，15 mL/100 mL金耳發酵液能夠提高單一菌酸奶酸度[26]。試驗中黃綠蜜環菌和虎掌菌發酵液用量超過10 mL/100 mL后，混合菌酸奶酸度上升處于緩慢或者平穩趨勢，可能是食用菌發酵液中多糖能夠在一定程度上抑制發酵劑的發酵產酸[23]。

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2.4 對酸奶持水力的影響

由圖4可知，隨著發酵液用量的增加，黃綠蜜環菌混合菌酸奶持水力逐漸下降，虎掌菌混合菌酸奶持水力先增加后降低。有研究[26-27]表明，金耳發酵液酸奶或靈芝—白靈菇酸奶的持水力高于對照組。試驗中，混合菌酸奶的持水力在5 mL/100 mL發酵液時并未受到顯著影響甚至還有所提高，可能是酪蛋白在酸奶的酸性環境下會形成網狀的空間膠體結構，可以有效容納水分、小分子物質及乳酸菌。5～20 mL/100 mL黃綠蜜環菌發酵液混合菌酸奶持水性超過單一菌酸奶10%～30%，且混合菌酸奶持水力的最低水平與單一菌酸奶處于相同水平。當虎掌菌發酵液為5 mL/100 mL時混合菌酸奶持水力達到峰值87%，而其單一菌酸奶持水力較對照組顯著減弱(P<0.05)。但當兩種菌體發酵液添加量超過10 mL/100 mL后，較對照組有明顯減弱，可能是由于酸奶的持水力受酸奶內總固形物及蛋白質含量變化的影響[28]。而試驗發現采用混合菌發酵制作酸奶時，5 mL/100 mL 的虎掌菌發酵液持水力最高，且較黃綠蜜環菌酸奶強。

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2.5 對酸奶中蛋白質含量的影響

由圖5可知，當黃綠蜜環菌或虎掌菌發酵液添加量增加時，黃綠蜜環菌單一菌酸奶蛋白質含量先降低后增加，虎掌菌混合菌酸奶蛋白質含量先降低后增加。除了15，25～30 mL/100 mL兩個添加水平外，黃綠蜜環菌發酵液制成的單一菌酸奶蛋白質含量均顯著低于對照組，虎掌菌發酵液單一菌酸奶與混合菌酸奶蛋白質含量均低于對照組(P<0.05)。Abd-Rabou等[29]用駱駝奶和藜麥制作混合發酵乳，發現添加藜麥種子制作的發酵乳中的蛋白質含量顯著提高；Xiong等[30]研究發現蟬擬青霉發酵液制得的酸奶蛋白質含量顯著高于天然酸奶蛋白質含量，與試驗結果不一致，可能與研究使用的真菌發酵液中的成分、添加量及乳酸菌活性有關，尤其是酸奶中環境條件如pH影響著真菌產生的蛋白酶穩定性以及活性。添加5～20 mL/100 mL黃綠蜜環菌發酵液時，混合菌酸奶蛋白質含量比單一菌酸奶蛋白質含量高20%～230%。

2.6 對酸奶中脂肪含量的影響

由圖6可知，除10 mL/100 mL虎掌菌發酵液脂肪含量相比于對照組不顯著外，其余添加量黃綠蜜環菌和虎掌菌發酵液單一菌酸奶和混合菌酸奶脂肪含量均顯著低于對照組(P<0.05)，可能是發酵液中存在脂肪酶，而其穩定性與活性又受到環境條件的影響。添加黃綠蜜環菌發酵液后，單一菌酸奶中脂肪含量高于混合菌酸奶脂肪含量20%～70%，且10～25 mL/100 mL虎掌菌發酵液單一菌酸奶脂肪含量高于混合菌酸奶。結合圖5可知，混合菌酸奶蛋白質含量高于單一菌酸奶，單一菌酸奶脂肪含量比混合菌酸奶高，可能與發酵劑菌種的生理特性有關。

大寫字母不同表示接入混合菌的酸奶之間差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示接入單一菌的酸奶之間差異顯著(P<0.05)

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2.7 對酸奶中磷含量的影響

由圖7可知，當發酵液添加量增加時，黃綠蜜環菌單一菌和混合菌酸奶磷含量呈先降低后增加趨勢；虎掌菌單一菌酸奶磷含量逐漸減少，混合菌酸奶磷含量先增加后減少。添加黃綠蜜環菌發酵液后單一菌酸奶磷含量顯著低于對照組(P<0.05)，添加量為15～30 mL/100 mL時混合菌酸奶磷含量顯著高于對照組(P<0.05)。當黃綠蜜環菌發酵液添加量為15～20 mL/100 mL時，混合菌酸奶磷含量比單一菌酸奶磷含量高50%。與對照組相比，除10 mL/100 mL虎掌菌發酵液磷含量不顯著外，其余單一菌酸奶磷含量顯著降低(P<0.05)，15～30 mL/100 mL虎掌菌發酵液混合菌酸奶磷含量顯著降低(P<0.05)。

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2.8 對酸奶中鉀含量的影響

由圖8可知，黃綠蜜環菌混合菌酸奶和單一菌酸奶鉀含量隨發酵液用量增加呈先升后降趨勢。黃綠蜜環菌發酵液除5，30 mL/100 mL兩個添加量外，其余添加量發酵液單一菌酸奶鉀含量較混合菌酸奶高。黃綠蜜環菌發酵液為5 mL/100 mL時，混合菌酸奶鉀含量顯著高于對照組(P<0.05)。添加虎掌菌發酵液后，單一菌酸奶和混合菌酸奶鉀含量均顯著高于對照組(P<0.05)。

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2.9 對酸奶中鈣含量的影響

由圖9可知，隨著發酵液添加量的增加，黃綠蜜環菌單一菌酸奶鈣含量先降低后升高；虎掌菌單一菌酸奶鈣含量先增加后減少，混合菌酸奶中鈣含量呈倒“U”形。除了25 mL/100 mL黃綠蜜環菌發酵液制得的單一菌酸奶鈣含量顯著高于對照組外，其余用量的黃綠蜜環菌發酵液單一菌和混合菌酸奶鈣含量顯著低于對照組(P<0.05)，且添加量為25 mL/100 mL時，單一菌酸奶鈣含量比混合菌酸奶高127%。與對照組相比，添加10～15 mL/100 mL 虎掌菌發酵液時，單一菌酸奶和混合菌酸奶鈣含量顯著上升(P<0.05)，與香菇菌液發酵酸奶中鈣含量高于原味酸奶的結果[31]相似，且虎掌菌發酵液添加量為15 mL/100 mL時，單一菌酸奶鈣含量比混合菌酸奶高30%。一般純牛奶中鈣含量豐富，經發酵后，鈣等礦物質不會發生變化，然而試驗中發現黃綠蜜環菌和虎掌菌發酵液用量對酸奶中鈣含量的影響有差別，可能與發酵液中不同的生物質作用于乳酸菌菌體活性有關，其鈣含量變化的規律性有待探討。

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2.10 對酸奶中鐵含量的影響

由圖10可知，當黃綠蜜環菌發酵液用量增加時，混合菌酸奶鐵含量先降低后增加，而單一菌酸奶鐵含量先增加后降低。添加5 mL/100 mL黃綠蜜環菌發酵液時單一菌酸奶鐵含量顯著高于對照組(P<0.05)，20 mL/100 mL發酵液單一菌酸奶與對照組無顯著差異，其他添加量的發酵液單一菌和混合菌酸奶鐵含量均顯著低于對照組(P<0.05)。虎掌菌發酵液添加量為15 mL/100 mL 時，單一菌酸奶鐵含量較對照組顯著增加(P<0.05)；當添加20～30 mL/100 mL 虎掌菌發酵液時，混合菌酸奶鐵含量顯著高于對照組(P<0.05)，尤其是發酵液添加為25 mL/100 mL時，其鐵含量達到最高。有研究[30-31]表明，一定量的蟬擬青霉或香菇菌液發酵液能夠提高酸奶中鐵含量。添加發酵液后酸奶部分礦質元素含量變化規律與張鳳琴等[31]研究結果有所差異，可能是由制作酸奶的原料、加入的發酵劑菌株、發酵條件以及食用菌發酵液中礦質元素含量不同等多種因素交互作用的結果。

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3 結論

添加不同量的黃綠蜜環菌和虎掌菌發酵液或使用不同發酵劑時，混合菌酸奶感官評分、持水力均高于單一菌酸奶；除30 mL/100 mL黃綠蜜環菌發酵液外，添加其他發酵液由混合菌制成的酸奶酸度均優于單一菌酸奶；與對照組相比，添加黃綠蜜環菌發酵液的混合菌酸奶蛋白質、磷含量增加，混合菌制成的虎掌菌發酵液酸奶中鈣、鉀、鐵含量顯著提高(P<0.05)。利用低添加量的兩種食用菌發酵液可改善酸奶理化性質(感官指標、pH、酸度、持水力)及營養成分(蛋白質、脂肪、礦質元素)，今后將進一步確定酸奶中硒含量及硒化學形態；為了迎合現代消費觀念或特殊人群的需求，新型酸奶應具有營養豐富和功能性俱佳的特性，而這些特性與代謝產物有著密切關系，亟待借助代謝組學的方法解析富硒酸奶的代謝產物種類和含量，以預測其感官、營養和功能等特性。