靈芝屬9個(gè)野生菌株的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

胡 佳 戴 丹 彭新紅 孫 鵬 王洪秀 陳緒濤 王 振 熊澤亞 魏云輝*

（1江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，江西南昌 330200；2江西省科學(xué)院生物資源研究所，江西南昌 330096）

靈芝屬GanodermaP.Karst.隸屬擔(dān)子菌門Basidiomycota、傘菌綱Agaricomycetes、多孔菌目Polyporales、靈芝科Ganodermataceae，是分布廣泛的一類大型食藥用真菌[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材。靈芝富含三萜類化合物、靈芝多糖等多種藥用成分，具有抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫力等生物活性[2]。我國(guó)的靈芝種質(zhì)資源非常豐富，但是目前已經(jīng)被開發(fā)利用的靈芝種類有限，靈芝栽培品種也比較混亂[3]。江西省野生靈芝屬種質(zhì)資源豐富，開展野生靈芝菌株的收集、鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析，對(duì)于豐富靈芝屬種質(zhì)資源庫，挖掘和開發(fā)優(yōu)良靈芝菌株，選育優(yōu)良靈芝新品種等都具有重要的意義。

真菌核糖體DNA（rDNA）的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）由于承受的進(jìn)化壓力較小，因此容易產(chǎn)生更多的變異，表現(xiàn)出廣泛的序列多態(tài)性[4-5]，是目前真菌分類和鑒定的重要依據(jù)之一[6]。ITS 序列分析的方法廣泛應(yīng)用于真菌分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育等研究[7-10]。

基于ITS 序列測(cè)序與分析對(duì)9 個(gè)野生靈芝屬菌株進(jìn)行分子鑒定，并通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析9個(gè)野生靈芝菌株與31 個(gè)國(guó)內(nèi)栽培靈芝菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為野生靈芝屬菌株的馴化栽培、新品種選育等工作提供參考依據(jù)，為今后的種質(zhì)鑒定及遺傳育種等研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株：研究菌株包括采自江西省的9個(gè)野生靈芝屬菌株（表1），31 個(gè)國(guó)內(nèi)栽培靈芝菌株（表2）作為對(duì)照組，1 個(gè)云芝菌株和1 個(gè)牛樟芝菌株作為外類群組（表3）。

表1 采自江西省的野生靈芝菌株

表2 試驗(yàn)收集栽培靈芝菌株

表3 外類群組菌株

（2）培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基，每1 000 mL 中含有200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖和20 g瓊脂粉，pH自然。

（3）主要試劑：植物基因組DNA 提取試劑盒DP305、2×Taq PCR 預(yù)混試劑（北京天根生化科技有限公司），DL2000 DNA Marker、TS-GelRed 核酸凝膠染料（北京擎科生物科技有限公司），引物（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野生靈芝子實(shí)體采集、組織分離與菌種保藏

圖1 供試靈芝G06菌株生境照

采集前記錄野生靈芝生境，采集過程中保證野生靈芝子實(shí)體完整。選取新鮮子實(shí)體進(jìn)行組織分離，用75%酒精消毒子實(shí)體表面后，用無菌手術(shù)刀剖開菌蓋，取菌肉部分接種于PDA 培養(yǎng)基斜面，于28 ℃避光培養(yǎng)。待菌絲萌發(fā)后挑取無污染的尖端菌絲轉(zhuǎn)接至PDA 斜面進(jìn)行純化培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面后保藏菌種。

1.2.2 菌絲培養(yǎng)和基因組DNA提取

從母種斜面挑取少量菌絲培養(yǎng)物接種至PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿平板。收集菌絲和提取基因組DNA 參照王洪秀等[7]方法，提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ITS序列擴(kuò)增

用真菌ITS 通用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3' 和ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'[11]作為引物，對(duì)所有供試菌株的ITS 序列進(jìn)行擴(kuò)增。25μL PCR 反應(yīng)體系如下：2×Taq PCR預(yù)混試劑12.5μL、引物ITS1 1μL、引物ITS4 1μL、DNA模板1μL、ddH2O 9.5μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序與序列分析

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶后，交由上海生工生物工程有限公司純化測(cè)序。測(cè)得的序列在NCBI 的GenBank 中進(jìn)行Blast 比對(duì)，分析獲得同源序列。在Clustal X 中進(jìn)行多序列比對(duì)，切去兩端不整齊的堿基，導(dǎo)入MEGA 7.0 中計(jì)算成對(duì)遺傳距離，采用Kimura 2-parameter 模型，空位數(shù)據(jù)作為完全缺失（Complete deletion）處理，轉(zhuǎn)換（Transition，Ti）和顛換（Transversion，Tv）的權(quán)重相同。最后以云芝（G41）和牛樟芝（G42）為外類群，采用最大似然法（maximum likelihood，ML），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，基于Kimura 2-parameter 計(jì)算模型，經(jīng)過1000次Bootstrap可信度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列擴(kuò)增結(jié)果

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶清晰（圖2），長(zhǎng)度在650 bp左右。

圖2 供試靈芝菌株ITS序列電泳圖

2.2 野生菌株同源序列分析

將9 個(gè)野生靈芝菌株的ITS 序列在GenBank 中比對(duì)，選擇綜合評(píng)分最高的同源序列（表4）。結(jié)果所有野生菌株均為靈芝屬，其中G01 的同源菌株為紫芝Ganoderma sinense，G02、G03 的同源菌株為樹靈芝Ganoderma sessile，G04 的同源菌株為南方靈芝Ganoderma australe，G05、G07、G08 的同源菌株為有柄靈芝Ganoderma gibbosum，G06、G09 的同源菌株為靈芝Ganoderma lingzhi。9個(gè)野生菌株的ITS序列提交至GenBank，登錄號(hào)為OL744615-OL744623。

表4 野生靈芝菌株ITS序列在GenBank中的同源性比對(duì)結(jié)果

2.3 靈芝屬菌株ITS序列分析

將40 個(gè)靈芝屬菌株ITS 序列進(jìn)行多序列比對(duì)，序列長(zhǎng)度在576～595 bp，G+C（鳥嘌呤+胞嘧啶）含量在46.22%～49.66%（表5）。G+C 含量可以反映屬種間的親緣關(guān)系，不同物種的DNA 中G+C 含量不同，G+C 含量差異越大，說明其親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，反之則說明親緣關(guān)系越近[4]。由表5 可見，靈芝屬40 個(gè)菌株中G+C含量差異較大，說明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表5 靈芝屬40個(gè)菌株的ITS序列長(zhǎng)度和G+C含量

靈芝屬40 個(gè)菌株ITS 序列的變異統(tǒng)計(jì)見表6。在ITS 序列中有438 個(gè)保守位點(diǎn)（Conserves sites），163 個(gè)變異位點(diǎn)（Variable sites），106 個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（Parsimony-informative sites）以及57 個(gè)自裔位點(diǎn)（Singleton sites），變異率為27.03%，說明靈芝群體間的差異較大。轉(zhuǎn)換/顛換（R）值為2.12，轉(zhuǎn)換多于顛換，這與之前的報(bào)道結(jié)論相一致[12]。

表6 試驗(yàn)靈芝屬40個(gè)菌株ITS序列的變異情況

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

以外類群組中G41、G42 以及從GenBank 下載的云芝（KY628331.1）和牛樟芝（MK764937.1）ITS 序列作為外類群，對(duì)9個(gè)野生靈芝菌株、對(duì)照組中靈芝屬31 個(gè)栽培菌株以及8 個(gè)來自GenBank 的靈芝屬ITS 序列進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，除外類群G41（云芝Trametes versicolor）和G42（牛樟芝Antrodia camphorata）各自分為兩類組外，靈芝屬菌株（G01—G40）聚為9 個(gè)類組，第一類組：野生菌株G06 與栽培菌株G13、G14、G16、G17、G22、G23、G24、G26、G31、G36 聚為一組，由ITS 序列在GenBank 中進(jìn)行同源性比對(duì)可知，G06應(yīng)為靈芝Ganoderma lingzhi，與我國(guó)大部分栽培菌株親緣關(guān)系較近；第二類組：栽培菌株G10、G12、G15、G25、G34、G38、G40 聚為一組；第三類組：野生菌株G09 與栽培菌株G33 聚為一組，說明二者的親緣關(guān)系較近；第四類組：G30 獨(dú)自為一組，與靈芝Ganoderma lingzhi（MN372059.1）親緣關(guān)系較近；第五類組：栽培菌株G11、G18、G39 與亮蓋靈芝Ganoderma lucidum（JQ520176.1）聚為一組；第六類組：野生菌株G02、G03 與栽培菌株G19、G28、G29、G37 聚為一組，與樹靈芝Ganoderma sessile（MG654317.1）親緣關(guān)系較近；第七類組：栽培菌株G32 單獨(dú)為一組，與亮蓋靈芝Ganoderma lucidum（KX262903.1）親緣關(guān)系較近；第八類組：野生菌株G01 與栽培菌株G20、G21、G27、G35 以 及 紫 芝Ganoderma sinense（MH106882.1）聚為一組；第九類組：野生菌株G04、G05、G07、G08 聚為一組，與南方靈芝Ganoderma australe（JX195205.1）、有柄靈芝Ganoderma gibbosum（MZ823626.1）親緣關(guān)系較近。試驗(yàn)靈芝屬40個(gè)菌株親緣關(guān)系差異較大，遺傳背景較豐富。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)與討論

由于真菌種類繁多，個(gè)體多態(tài)性明顯，且個(gè)體形態(tài)易受生態(tài)環(huán)境及其他因素的影響，因此僅僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定還不夠準(zhǔn)確。ITS1 和ITS2 屬于中度保守區(qū)段，表現(xiàn)為種間差異較明顯，而種內(nèi)相對(duì)一致的特點(diǎn)，而且這種鑒定方法允許少量的錯(cuò)配或序列分析誤差。因此，ITS 序列分析是真菌物種分子鑒定的有效手段，也適于屬內(nèi)種間或種內(nèi)差異較大的菌株間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析，是傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法的重要補(bǔ)充[13-15]。研究基于ITS 序列分析對(duì)江西省9 個(gè)野生菌株進(jìn)行分子鑒定，確定9 個(gè)菌株均為靈芝屬，將9 個(gè)野生靈芝菌株中的靈芝、紫芝、南方靈芝、樹舌亞屬等類組區(qū)分開來，并通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析野生菌株與栽培菌株之間的親緣關(guān)系。

對(duì)9 個(gè)野生靈芝屬菌株的鑒定與分類，有助于更好地對(duì)其評(píng)價(jià)與利用。其中野生紫芝G01，有著較大的開發(fā)潛力，后期可以開展G01 菌株的馴化栽培工作，與現(xiàn)有的紫芝栽培品種進(jìn)行產(chǎn)量、藥用成分、商品性的比較試驗(yàn)，挖掘其優(yōu)良性狀，為紫芝的品種選育提供基礎(chǔ)材料。靈芝Ganoderma lingzhi是我國(guó)主要的栽培品種[16]，對(duì)G06、G09開展馴化，可豐富靈芝的栽培品種。雖然關(guān)于南方靈芝栽培的報(bào)道較少，但已有研究表明南方靈芝中含有多種萜類化合物、生物堿[17-18]和免疫調(diào)節(jié)蛋白[19]等藥用成分，具有抗氧化、α-糖苷酶抑制等活性[20]，可對(duì)G04進(jìn)一步開展生物學(xué)特性、藥用價(jià)值等研究。綜上所述，ITS 序列分析為野生靈芝菌株的鑒定、分類以及種質(zhì)資源評(píng)價(jià)等提供理論基礎(chǔ)，為野生靈芝種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

但是，ITS 序列分析的準(zhǔn)確性受數(shù)據(jù)庫中的核酸信息是否準(zhǔn)確、是否完善影響，存在一定的局限性。在今后的研究中，可開展ITS、TEF1-α 和LSU等多基因分析，并與ISSR、RAPD、SRAP[21]、InDel[22]等多種分子標(biāo)記相結(jié)合，進(jìn)一步研究靈芝的遺傳多樣性。同時(shí)從栽培特性、農(nóng)藝性狀和藥用成分等角度開展靈芝種質(zhì)資源評(píng)價(jià)，為靈芝種質(zhì)資源開發(fā)利用提供更豐富的理論依據(jù)。