基于生物信息學(xué)分析胃癌中MMP7表達(dá)及臨床意義

王繹博

(佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

胃癌是全球范圍常見的惡性腫瘤之一，它是第四大最常診斷癌癥及第三大癌癥死亡病因〔1〕。研究表明，2018年全球新增胃癌病例多達(dá)100萬例，且有約78.3萬人死于該病〔2〕。胃癌的發(fā)病有明顯的性別和地域差異，表現(xiàn)為男性高于女性，東亞高于北美、北歐和非洲地區(qū)〔2〕。目前認(rèn)為，幽門螺桿菌是胃癌的主要危險因素，有近90%的非賁門性胃癌與其相關(guān)〔3〕。此外，一些飲食和生活習(xí)慣，如食用腌制食物、低水果攝入、飲酒和吸煙也是明確的胃癌風(fēng)險因素〔2〕。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)由前肽序列、催化結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)和血凝素(PEX)結(jié)構(gòu)域組成〔4〕。研究表明，MMPs可通過消化細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分和刺激細(xì)胞表面蛋白，在ECM的重構(gòu)中起至關(guān)重要的作用〔5〕。此外，MMPs還可以控制其他蛋白酶、生長因子、趨化因子和細(xì)胞受體活性，并調(diào)節(jié)許多生物學(xué)功能〔6〕。研究表明，腫瘤演進(jìn)過程中的腫瘤生長、局部侵襲和轉(zhuǎn)移在很大程度上也依賴于MMPs的蛋白水解活性，它們通過降解ECM成分和釋放基質(zhì)因子、細(xì)胞表面結(jié)合的細(xì)胞因子、生長因子等影響腫瘤免疫細(xì)胞招募和惡性轉(zhuǎn)化過程〔7〕。MMP7是MMPs家族中最小的酶類，其具有MMPs的共同特征，即降解酪蛋白、纖維連接蛋白、明膠和蛋白聚糖〔8〕。越來越多的證據(jù)表明，MMP7通過減少細(xì)胞黏附、抑制癌細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)血管生成，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用〔9,10〕。此外，MMP7也被認(rèn)為參與了腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲和炎癥級聯(lián)反應(yīng)〔10,11〕。本研究利用生物信息學(xué)方法探討MMP7在胃癌中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)收集與預(yù)處理 從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome.nih.gov)下載胃癌和正常胃組織RNA-seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)，并進(jìn)行每百萬轉(zhuǎn)錄本(TPM)標(biāo)準(zhǔn)化，將TPM值作為樣本的表達(dá)值。另外，除了基因表達(dá)數(shù)據(jù)，還下載了每個患者的臨床參數(shù)，如年齡、性別、種族、生存狀態(tài)、腫瘤等級、腫瘤分期等。

1.2差異基因識別 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/)計算每個基因在正常和腫瘤樣本中的平均TPM值，并進(jìn)行兩組樣本間的差異統(tǒng)計，根據(jù)顯著性識別到了正常和腫瘤樣本之間的差異表達(dá)基因，最后保留前25個顯著高表達(dá)的基因并以熱圖形式展示。

1.3差異表達(dá)分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫計算正常非癌組織與癌組織的MMP7基因表達(dá)水平。此外，利用臨床患者數(shù)據(jù)對原發(fā)腫瘤樣本進(jìn)行分類，并生成不同亞組中每個基因的表達(dá)水平。

1.4生存分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫用Kaplan-Meier(K-M)繪制生存率曲線。為了評估基因表達(dá)和臨床參數(shù)如患者種族、性別等的組合生存效果，采用多變量Kaplan-Meier生存分析。使用Log-rank檢驗計算組間差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性。

1.5免疫浸潤分析 使用TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)確定MMP-7基因表達(dá)與相關(guān)基因、免疫浸潤的關(guān)系。根據(jù)6種類型的免疫浸潤細(xì)胞(包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)的豐度與MMP-7基因表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗和秩和檢驗，不符合正態(tài)分布的采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。Pearson相關(guān)性分析用于識別與MMP7基因顯著相關(guān)的基因。

2 結(jié) 果

2.1MMP7在胃癌組織中表達(dá) 胃癌組織中高表達(dá)基因的分布表明，MMP7為胃癌中第7位高表達(dá)基因(圖1)。與非癌組織〔2.462(0.120，9.138)〕比較，胃癌患者組織中MMP7表達(dá)水平〔29.558(7.698，101.378)〕顯著升高(P<0.01)。對患者年齡分析可見，41～60歲、61～80歲患者組織的MMP7表達(dá)水平顯著高于非癌組織(P<0.05)。此外，男性、女性、白種人及亞裔患者M(jìn)MP7表達(dá)量均明顯高于非癌組(P<0.05)。見表1。

圖1 胃癌中25個顯著高表達(dá)基因熱圖

表1 非癌組及不同年齡、性別、種族胃癌患者M(jìn)MP7表達(dá)

2.2MMP7與胃癌中高表達(dá)基因的相關(guān)性 胃癌中MMP7與前6位高表達(dá)基因中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CST)1、Ⅰ型膠原α1鏈(COL10A1)、MMP11、同源盒(HOX)A10、膠原三螺旋重復(fù)蛋白(CTHRC)1具有顯著相關(guān)性(r=0.164、0.144、0.194、-0.181、0.163；均P<0.05)，而與分泌型磷蛋白(SPP)1無相關(guān)性(r=0.053；P>0.05)。見圖2。

2.3不同臨床病理參數(shù)胃癌患者的MMP7表達(dá)情況 Grade 1、2、3級患者組織的MMP7表達(dá)水平均顯著高于非癌組，且Grade 3級顯著高于Grade 1級。此外，Stage Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者組織的MMP7表達(dá)水平也均顯著高于非癌組(P<0.05)。與非癌組比較，有和無TP53突變患者組織的MMP7水平均顯著升高(P<0.001)。見表2。

圖2 MMP7與胃癌中高表達(dá)基因具有顯著相關(guān)性

2.4不同組織分型、幽門螺旋桿菌感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者的MMP7表達(dá)情況 與非癌組比較，非特異性腺癌、彌漫性腺癌、印戒細(xì)胞腺癌、非特異性腸型腺癌、腸型管狀腺癌、腸型乳頭狀腺癌的MMP7表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，但腸型黏液腺癌與非癌組無顯著差異(P>0.05)。印戒細(xì)胞腺癌和腸型乳頭狀腺癌組的MMP7表達(dá)水平顯著低于非特異性腺癌和彌漫性腺癌組(P<0.05)。此外，有(或無)幽門螺旋桿菌感染、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期患者M(jìn)MP7表達(dá)量均明顯高于非癌組(P<0.05)。見表3。

2.5MMP7表達(dá)上調(diào)與胃癌患免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)性 免疫細(xì)胞浸潤評估顯示，MMP7高表達(dá)與胃癌中的CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞浸潤相關(guān)(r=0.183、0.112、0.228、0.186，均P<0.05)，而與B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞浸潤無關(guān)(r=-0.077、0.004，均P>0.05)。見圖3。

表2 不同臨床病理參數(shù)胃癌患者M(jìn)MP7表達(dá) 情況

2.6MMP7表達(dá)上調(diào)可反映胃癌患者預(yù)后不良 生存分析顯示，高表達(dá)MMP7患者總體生存率顯著低于低/中表達(dá)組。多變量Kaplan-Meier生存分析顯示，MMP7高表達(dá)的男性患者和亞裔患者的預(yù)后最差。見圖4。

表3 不同組織分型、幽門螺旋桿菌感染、 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者的MMP7表達(dá)

圖3 MMP7表達(dá)上調(diào)與胃癌患免疫細(xì)胞浸潤具有相關(guān)性

圖4 MMP7表達(dá)上調(diào)可反映胃癌患者預(yù)后不良

3 討 論

正常和病理情況下ECM蛋白的水解及各種細(xì)胞表面分子的加工過程是由一大類依賴鋅的蛋白酶介導(dǎo)的，包括約24個MMPs，35個解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMs)和19個含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS)〔12〕。MMPs家族根據(jù)其結(jié)構(gòu)域可被分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶酶、母質(zhì)溶酶和模型MMPs(MT-MMPs)〔13〕。MMPs可在生理和病理狀態(tài)下調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、遷移、存活和黏附。由于MMPs的關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平的失調(diào)和激活可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、生存、侵襲、惡性轉(zhuǎn)化和免疫失調(diào)〔14,15〕。腫瘤微環(huán)境(TME)是由實體腫瘤團(tuán)塊內(nèi)的細(xì)胞、ECM中的生化和生物物理成分相互作用形成的。在TME中含有大量的MMPs底物，包括天然的纖維膠原蛋白、變性的明膠及層粘連蛋白。MMPs可通過影響TME中 ECM的重構(gòu)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展和侵襲〔7〕。

MMP7也稱為基質(zhì)溶解素，可調(diào)控多種病理生理過程，如傷口愈合、衰老、骨生長、炎癥和血管生成等〔9〕。MMP7上調(diào)已在多種人類癌癥類型中得到證實，這包括肺癌、黑色素瘤、食道癌、膽囊癌、胰腺癌、膀胱癌等。研究表明，下調(diào)MMP7可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔16〕。本研究結(jié)果顯示，在胃癌中高表達(dá)的前7位基因，均被證實可通過Wnt、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β2/Smad/甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(METTL)3、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α/趨化因子受體(CXCR)4等多條信號通路來促進(jìn)胃癌進(jìn)程〔17～21〕。本研究結(jié)果提示，MMP7可作為評估胃癌進(jìn)程的生物標(biāo)志物。Zhu等〔22〕在宮頸癌的研究中也證實了較高的MMP7表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、病理分級和臨床分期具有相關(guān)性。胃癌是一種高度異質(zhì)性腫瘤，因此病理組織學(xué)分型的臨床實用性十分有限，Lauren根據(jù)組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)行為提出的胃癌分型則被認(rèn)為是最具預(yù)后價值的組織學(xué)分型〔23〕。本研究結(jié)果顯示，各型MMP7表達(dá)較正常組織均顯著上調(diào)。研究證實，在TME中，MMPs也可引導(dǎo)免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(間充質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞)的過度募集，導(dǎo)致腫瘤組織的進(jìn)一步混亂，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和擴(kuò)散〔12〕。基于此，本實驗最后研究了MMP7與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果提示MMP7參與了胃癌的免疫學(xué)進(jìn)程和機制。

綜上，MMP7為胃癌中高表達(dá)基因，且其表達(dá)與其他促進(jìn)胃癌進(jìn)程的高表達(dá)基因具有顯著相關(guān)。此外，上調(diào)表達(dá)的MMP7還與胃癌患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后不良、免疫細(xì)胞募集等具有相關(guān)性。