Skp2蛋白與原發性胃癌預后的關系

張永健 郭學海 高秀鳳 王斌 趙宏陽 張敬

(開灤總醫院林西醫院 1普外科，河北 唐山 063103；2消化內科)

原發性胃癌是常見的胃腸道惡性腫瘤之一，發病率居我國第2位，死亡率居惡性腫瘤第3位，具有高發病率和高死亡率的特點〔1,2〕。胃癌的發病機制目前尚不明確，大多數患者在確診時已屬于胃癌中晚期，治療效果和愈后不佳，因此，胃癌的發生發展和浸潤轉移機制的研究對于患者的治療和愈后有重要意義。胃癌主要的治療方式為手術治療，輔以放化療，早期胃癌患者通過早期手術可明顯提高治療效果，5年生存率可達50%以上，但是晚期胃癌往往治療效果不佳，因此早發現和早治療對于胃癌患者的預后和減少經濟負擔有重要意義〔3,4〕。目前胃癌臨床領域中缺少公認的預后標志物，尤其對于中晚期胃癌患者，一線化療方案的無進展生存時間僅6～9個月〔5〕。研究發現惡性腫瘤發病機制之一為細胞周期調節紊亂，細胞S期激酶相關蛋白(Skp)2是F-box蛋白家族成員之一，在細胞周期調節中發揮重要作用，在腫瘤的發生和發展中有重要意義〔6,7〕。研究發現Skp2不僅參與降解蛋白酶體，并且與致癌有關的轉錄基因c-myc的泛素化相關，是目前研究的重點和熱點〔8〕。p27是近年來研究較為熱門的抑制癌癥發生發展的調控基因，p27通過阻止各種細胞經過G1-S期。p27表達水平低和癌癥的預后不好和惡性腫瘤的程度是相互有關系。實驗證明 Skp2蛋白在腫瘤中的表達及癌癥臨床病理學行為有密切相關。Skp2過表達與許多腫瘤的發生、發展和預后密切相關。這些與腫瘤的早期診斷及治療有密切關系。本研究分析Skp2蛋白在胃癌中的表達情況，并探討Spk2蛋白與原發性胃癌預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年6月至2018年11月于開灤總醫院林西醫院就診的原發性胃癌患者67例為觀察組，并納入63例病理組織檢查正常非癌性胃黏膜為對照組，觀察組平均年齡(65.46±6.89)歲，男36例，女31例，對照組平均(66.15±7.41)歲，男29例，女34例。收集兩組性別、年齡、病程、病理分期等一般資料。每3個月通過門診或電話形式進行隨訪，末次隨訪時間2020年1月。本研究經醫院倫理委員會批準，患者及其家屬同意簽署知情同意書。納入標準：(1)患者確診為原發性胃癌患者；(2)病理診斷和病理分期明確。(3)患者臨床資料完整。排除標準：(1)患者曾接受過化療、放療等抗腫瘤治療；(2)患合并其他系統嚴重病變者； (3)患者不同意簽署知情同意書。

1.2觀察指標

1.2.1試驗操作 所有患者取病理組織，所有胃癌組織均在離體30 min內切取，置于0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理過的干燥試管中(試管內加入RNA保護液)，然后放入-80℃冰箱中保存。胃癌組織芯片常規脫蠟并且梯度酒精水化，用3% H2O2覆蓋組織15 min，消化內源性過氧化物酶，抗原修復采用枸櫞酸鹽修復液在92℃煮15 min，冷卻至室溫；滴加一抗Ezrin，濕盒內4℃冰箱過夜，滴加免疫組化試劑PV-9000免疫復合物，溫箱內孵育半小時，二氨基聯苯胺(DAB)室溫顯色3～10 min，流水沖洗15 min；蘇木素復染細胞核15 s；梯度酒精脫水，樹膠片封片。每一步驟間均用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。DAB顯色試劑盒和PV-9000試劑盒及購于北京中杉金橋生物技術有限公司，所有操作按照說明書嚴格進行操作。

1.2.2結果判讀〔9〕Skp2蛋白在胃癌組織上皮細胞的細胞核呈棕黃色顆粒，隨機選擇5個高倍視野(400倍)計數陽性細胞數，取其平均值作為該例的陽性率，并判定細胞染色強度。陽性細胞比例評定標準：>75%為4，51%～75%為3，26%～50%為2，5%～25%為1，<5%為0。染色強度評分標準：棕褐色為3，棕黃色為2，淡黃色為1，無著色為0。兩項結果相加為標記指數(LI)，并通過LI判斷表達強度和表達陽性率。<2為陰性(-)，2～3為弱陽性(+)，4～5為中度陽性()，6～7為強陽性()。陽性率=(弱陽性+中度陽性+強陽性)/總例數。

1.3統計學分析 采用SPSS22.0軟件，非正態分布計量資料以中位數表示，正態分布采用t檢驗、χ2檢驗，繪制生存曲線，用Kaplan-Meier法計算，組間比較用Log-Rank 法檢驗。

2 結 果

2.1Skp2蛋白表達水平比較 觀察組Skp2蛋白表達陽性率(55.22%，其中強陽性21例，中度陽性10例，弱陽性6例，陰性30例)高于對照組(15.87%，其中強陽性3例，中度陽性4例，弱陽性3例，陰性53例)，差異有統計學意義(χ2=6.781，P<0.05)，見圖1。

圖1 Skp2蛋白在胃癌組織中表達水平(DAB，×200)

2.2Skp2蛋白表達水平與臨床資料相關性 Skp2蛋白表達陽性患者腫瘤分化程度、淋巴結轉移情況較陰性患者差，TNM分期、腫瘤直徑明顯大于Skp2蛋白表達陰性患者(P<0.05)，而性別、年齡、病程、浸潤深度無明顯差異(P>0.05)，見表1。

2.3Skp2蛋白陽性表達的Logistic回歸分析 以Skp2蛋白陽性表達為因變量，淋巴結轉移(有=1，無=0)、TNM分期、分化程度為自變量建立多元回歸模型，結果顯示淋巴結轉移(OR=1.174，P=0.004)、TNM分期(OR=1.340，P=0.005)、分化程度(OR=1.782，P=0.002)是Skp2蛋白陽性表達的危險因素，見表2。

表1 Skp2蛋白表達水平與原發性胃癌患者臨床資料相關性(n)

表2 原發性胃癌患者Skp2蛋白陽性表達的Logistic回歸分析

2.4Skp2蛋白表達與預后的關系 Skp2蛋白表達陽性中位生存時間為13個月(95%CI：10.4～16.2個月)，2年生存率為32.64%；Skp2蛋白表達陰性中位生存時間為27個月(95%CI：22.5～30.8個月)，2年生存率為68.63%。Kaplan-Meier 生存曲線分析發現Skp2蛋白表達陰性生存率明顯高于Skp2蛋白表達陽性組(P=0.001)，見圖2。

圖2 Skp2蛋白表達與原發性胃癌患者預后的關系

3 討 論

近年來，隨著診斷和治療水平的提高，胃癌的5年生存率明顯提高，但是在我國胃癌的死亡率占惡性腫瘤的死亡率的1/5左右，是危害人民身體健康和生命安全的主要疾病之一。加強對胃癌發生發展的研究，尋找與胃癌相關的生物學指標，將有助于胃癌的診療〔10,11〕。原發性胃癌的發生和發展使一個多因素、多階段、多基因共同作用的結果，細胞周期調節功能異常是細胞癌變中的一個重要過程，研究發現，多種細胞因子和癌性蛋白在調節細胞周期中起重要作用〔12,13〕。Skp2是由436個氨基酸殘基構成的蛋白，其基因定位于人的第5號染色體，Skp2通路編碼兩種蛋白質，Skp2B蛋白和Skp2蛋白，在正常細胞中，Skp2蛋白與Skp2B 蛋白表達可以通過泛素依賴作用抑制p5和Rb通路，，能與S期激酶cyclinA-CDKI相互作用，在G0/G1期表達較低，在S期表達相對較高，可通過轉化生長因子(TGF)-β信號轉導通路與Smad4 蛋白因子相互作用。當基因發生突變時，Skp2通過乙酰化作用和泛素化依賴的蛋白水解途徑與Smad4 蛋白因子的相互結合加強，通過乙酰化作用和泛素化依賴的蛋白水解途徑進一步使導致細胞調節周期紊亂，組織發生癌變，與腫瘤的發生發展和預后相關，是目前研究的熱點之一〔14,15〕。

本研究結果表明，Skp2在胃癌組織中的表達量明顯高于正常組織。研究發現〔16〕，Skp2在多種組織中表達增加，且與不良預后具有一定的相關性，不僅可通過泛素化途徑抑制Rb和p53通路，而且能降解抑癌基因p27，從而發揮調解細胞周期和調控腫瘤臨床病理行為的作用。廖順鴻〔17〕研究發現，Skp2蛋白在前列腺癌組織中高表達，而p27蛋白表達較低，且Skp2蛋白與p27蛋白存在負相關性，推測Skp2蛋白與p27蛋白在前列腺癌的發生和進展中發揮重要作用。劉小輝〔18〕采用組織免疫化學法發現Skp2蛋白在結直腸癌組織中高表達，且Skp2蛋白的靶標是p27，進一步證實了Skp2蛋白與p27蛋白在癌組織中的相關性。本研究結果表明，Skp2蛋白表達水平與腫瘤分化程度和TNM分期、淋巴結轉移情況、腫瘤大小相關。研究發現〔19〕，癌癥組織的腫瘤分型和大小、癌癥組織、淋巴管轉移與Skp2蛋白高表達相關，其機制目前研究尚不明確，猜測可能通過對凋亡的抵抗、潛在高侵襲性和活動性、高增殖活性等Skp2蛋白的生物學改變相關。孫雅靜〔20〕發現在霍奇金淋巴瘤患者中Skp2陽性率高時疾病的惡性程度越高，Skp2陽性程度與病理分級呈正比。郭云霞等〔21〕發現干擾Skp2表達后，肝癌細胞的增殖能力受抑制，細胞侵襲力下調，凋亡能力增強，進一步證實Skp2與肝癌細胞增殖能力，癌癥細胞的侵襲力相關。Shapira等〔15〕用免疫組化學染色法研究28例正常乳腺組織和69例乳腺癌組織中,觀察并比較Skp2在其中的表達情況，隨后用RT-PCR方法隨機檢測其中3例乳腺癌組織Skp2的mRNA 表達，并與其正常的胃黏膜作對比，結果顯示,Skp2的mRNA 在胃癌組織中的表達明顯上調，與正常胃黏膜比較Skp2蛋白陽性表達率在胃癌中明顯升高,Skp2蛋白陽性表達率隨著腫瘤的分化程度降低而升高，與本研究結果一致。

本研究結果表明，Skp2蛋白表達陽性組患者中位生存時間、5年生存率明顯高于Skp2蛋白表達陰性組，Skp2蛋白對于原發性胃癌的預后有一定的價值，臨床上可通過檢測Skp2蛋白的表達水平判斷胃癌患者的預后。吳金訓〔22〕對浸潤性宮頸癌患者的研究發現，Skp2蛋白可能是宮頸癌惡變的重要生物學標記物，與p27蛋白共同參與宮頸癌的發生發展，Skp2蛋白表達陽性患者的5年生存率明顯低于Skp2蛋白表達陰性患者。

綜上，Skp2蛋白胃癌組織中的表達水平增加，與腫瘤分化程度和分期、轉移情況、腫瘤大小相關，且Skp2蛋白表達陰性患者的預后明顯優于Skp2蛋白表達陽性患者，對判斷患者的預后有一定的價值。