復方蜥蜴散基于HIF-1α介導PI3K/AKT通路干預(yù)裸鼠胃癌浸潤轉(zhuǎn)移

李衛(wèi)強 蘭苗苗 景燕燕 朱西杰

(寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004)

胃癌是臨床常見惡性腫瘤之一，中國胃癌發(fā)病率居男性全身惡性腫瘤第二位，女性第四位〔1，2〕。研究表明，病變位于黏膜層及黏膜下層早期胃癌的防治，可使患者5年生存率達90%以上〔3〕，而浸潤轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者療效及預(yù)后的主要原因之一。因胃癌早期癥狀隱匿，發(fā)病機制尚不完全清楚，故開展高效低毒的有效藥物，特別是中醫(yī)藥抑制腫瘤浸潤遷移的療效及機制研究顯示出其重要性和迫切性。本研究前期應(yīng)用單味寧夏密點麻蜥及其為主組成的復方蜥蜴散治療胃癌前病變及胃癌等有多年臨床和實驗研究基礎(chǔ)〔4～10〕，證實密點麻蜥及復方蜥蜴散具有較好促進細胞凋亡，阻斷癌變的作用。本研究旨在進一步觀察復方蜥蜴散基于缺氧誘導因子(HIF)-1α介導磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 120只SPF級4周齡BALB/c裸鼠，雄性，體重(18±2)g，合格證編號：SCXK(寧)2015-0001。裸鼠飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司，合格證編號：18053223)。均由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2藥物及試劑 人SGC-7901胃腺癌細胞 (購自中國科學院上海生科院細胞資源中心)；復方蜥蜴散(密點麻蜥、黃芪、白術(shù)、半枝蓮、延胡索、山楂、白芍、三七、鹿角膠、甘草等)由寧夏醫(yī)科大學附屬回醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，煎成高、中、低濃度分別為0.27、0.13、0.06 g/ml藥液備用；華蟾素(陜西東泰制藥有限公司，Z20090846)：臨用前用蒸餾水配成9 mg/ml的混合液；5-氟尿嘧啶(FU)注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，1707051)：臨用前將原液(0.25 g/10 ml)用生理鹽水稀釋10倍，備用；生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，L118031403)；二甲苯(西隴科學股份有限公司，1330-20-7)；無水乙醇(西隴科學股份有限公司，64-17-5)；蘇木素(索萊寶科技有限公司，517-28-2)；山羊血清(索萊寶科技有限公司，517-28-2)；辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG(Jackson Immuno Research Inc，111-035-003)；蛋白G磁珠(Cell Signaling Technology，9006S)；蛋白質(zhì) Marker(Thermo Fisher Scientific，26634)；Tunel試劑盒(萬類生物，WLA029)。

1.3主要儀器 石蠟切片機〔萊卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司，RM2016〕；顯微鏡(尼康儀器有限公司，Eclipse Ci-L)；顯微鏡拍照系統(tǒng)(尼康儀器有限公司，Nikon DS-F12)等。

1.4造模 裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，采用人SGC-7901胃癌細胞株于裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射，制備胃癌移植瘤模型。經(jīng)穩(wěn)定傳代6次后，當皮下移植瘤長至直徑約10 mm，無菌操作下剝?nèi)∫浦擦觯瑢⑵淝谐? mm×1 mm×1 mm組織塊浸泡培養(yǎng)基內(nèi)備用。裸鼠腹部消毒麻醉后，于腹正中劍突下切開約1.5 cm進腹，在胃大彎側(cè)血管豐富區(qū)劃開胃漿膜層成“十”字，接種胃癌組織塊，OB膠覆蓋傷口后關(guān)腹，制備胃癌原位移植瘤模型。繼續(xù)飼養(yǎng)觀察4 w，期間觀察裸鼠活動、皮色、進食、體重、腹部體征等；分別于第8、15、22天選擇裸鼠處死剖腹探查了解成瘤情況，以腫瘤最大直徑約1 mm時為模型制備成功。

1.5分組及給藥 將造模成功裸鼠胃癌移植瘤模型隨機分為6組：模型對照組、華蟾素陽性對照組、5-Fu陽性對照組、復方蜥蜴散低劑量組(0.06 g/ml)、中劑量組(0.13 g/ml)、高劑量組(0.27 g/ml)。除模型對照組外，其余各組按照0.4 ml/20 g灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥6 w后停藥，給藥期間觀察裸鼠活動、皮色、進食、體重、腹部情況等，模型對照組給予等量生理鹽水。干預(yù)治療結(jié)束24 h后，處死各組裸鼠，觀察裸鼠腹腔內(nèi)瘤體情況，取腫瘤組織進行相關(guān)實驗檢測。

1.6Western印跡檢測HIF-1α、PI3K、p-AKT、AKT及EMT相關(guān)蛋白E-鈣黏蛋白(cadherin)、整聯(lián)蛋白(Integrin)-β3表達水平 將所取組織塊剪成小塊，按照每100 mg組織加入1 ml左右冷裂解液至其完全裂解后，離心取上清，即為全蛋白提取物。分裝保存于-80℃冰箱，避免反復凍融。用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒進行蛋白定量。經(jīng)蛋白樣品變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉顯影等，采集圖像，分別計算目的蛋白的灰度值。

1.7TUNEL檢測胃癌細胞凋亡 將腫瘤組織置于10%甲醛溶液中固定48 h，經(jīng)沖洗、包埋、梯度濃度酒精脫水、切片、脫蠟。最后用抗熒光衰減封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、最小顯著差異(LSD)t檢驗和秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學法檢測HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3及EMT相關(guān)蛋白表達 在細胞核或細胞質(zhì)中可見相關(guān)蛋白陽性表達，呈棕黃色。與模型對照組比較，藥物干預(yù)組HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3相關(guān)蛋白表達水平顯著降低，E-cadherin表達水平顯著升高(P<0.05)；與華蟾素、5-Fu陽性對照組比較，復方蜥蜴散不同劑量組HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3相關(guān)蛋白表達水平顯著降低，E-cadherin表達水平顯著升高(P<0.05)；與復方蜥蜴散低、中劑量組比較，高劑量組相關(guān)蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組相關(guān)蛋白表達比較(免疫組化，×400)

2.2TUNEL檢測各組藥物對細胞凋亡影響 凋亡細胞的細胞核內(nèi)經(jīng)染色呈黃色或棕黃色。與模型對照組比較，藥物干預(yù)組細胞凋亡率顯著增加(均P<0.05)；與華蟾素、5-Fu陽性對照組比較，復方蜥蜴散不同劑量組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與復方蜥蜴散低、中劑量組比較，高劑量組誘導細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。見表1、圖2。

2.3Western印跡檢測HIF-1α、PI3K、p-AKT、AKT及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Integrin-β3表達 與模型對照組比較，藥物干預(yù)組各組HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3表達水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin表達水平顯著升高(P<0.05)；與華蟾素、5-Fu陽性對照組比較，復方蜥蜴散不同劑量組各組E-cadherin表達水平顯著升高(P<0.05)，HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3表達水平顯著降低(P<0.05)；與復方蜥蜴散低、中劑量組比較，高劑量組E-cadherin表達水平顯著升高(P<0.05)，HIF-1α、PI3K、p-AKT、Integrin-β3表達水平顯著降低(P<0.05)。各組AKT表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖3、圖4。

表1 各組胃癌細胞凋亡率及HIF-1α、PI3K、p-AKT、E-cadherin、Integrin-β3表達光密度值比較

圖2 各組胃癌細胞凋亡(TUNEL，×400)

表2 各組HIF-1α、PI3K、p-AKT、E-cadherin、Integrin-β3表達比較

1～6：模型對照組、華蟾素陽性對照組、5-Fu陽性對照組、復方蜥蜴散低劑量組、復方蜥蜴散中劑量組、復方蜥蜴散高劑量組；下圖同圖3 各組HIF-1α、PI3K、p-AKT、AKT陽性表達

圖4 各組E-cadherin、Integrin-β3表達

3 討 論

細胞缺血缺氧微環(huán)境改變是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的普遍現(xiàn)象，而細胞生存微環(huán)境改變導致EMT發(fā)生是胃癌浸潤遷移的主要原因。因此，改善缺血缺氧微環(huán)境，阻斷EMT是防治胃癌、阻斷浸潤遷移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。《醫(yī)宗全鑒》對胃癌病因、癥狀有詳細闡述：“三陽熱結(jié)，謂胃、小腸、大腸三府熱結(jié)不散，灼傷津液也。胃之上口為賁門，小腸之上口為幽門……賁門干枯，則放出腐化之道路狹隘，故食入反出為翻胃也”〔11〕。本研究表明，毒瘀交阻是胃癌前病變、原位胃癌主要病機，并通過檢測胃癌前病變患者甲皺微循環(huán)，表明在管袢形態(tài)、管袢流態(tài)、管袢狀態(tài)方面存在不同程度異常、絡(luò)脈瘀滯、胃黏膜下血液的高凝狀態(tài)及細胞缺血缺氧微環(huán)境的改變〔12〕。因此，毒瘀交阻致脈絡(luò)瘀阻、黏膜缺血缺氧而失濡養(yǎng)，久則成癥瘕即胃癌，中西醫(yī)病機一致。

研究表明，EMT是癌變浸潤遷移極其重要的基礎(chǔ)，PI3K/AKT信號通路與多種惡性腫瘤形成及發(fā)展密切相關(guān)，是調(diào)控EMT主要信號通路，而缺血缺氧微環(huán)境改變是誘導EMT、促進胃癌發(fā)生及浸潤遷移的重要現(xiàn)象，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是維持細胞上皮表型的重要分子〔13～17〕。任何腫瘤在生長過程中，局部都會出現(xiàn)缺血缺氧狀態(tài)，腫瘤細胞存在著對缺血缺氧的自身調(diào)節(jié)，其機制主要是通過激活HIF-1α，參與提高葡萄糖轉(zhuǎn)運、糖酵解及腫瘤血管生成，為其浸潤生長提供必要條件。有學者認為，活性氧(ROS)與HIF-1α共同作用于胃黏膜，引起胃癌的發(fā)生〔18，19〕。因此，HIF-1α與胃癌發(fā)生及浸潤遷移關(guān)系密切。且PI3K/AKT等信號通路已被研究與HIF-1α介導的EMT密切相關(guān)〔16，20〕。

復方蜥蜴散以解毒通絡(luò)立法，應(yīng)用密點麻蜥為君藥，破結(jié)利水、消癭散結(jié)，《中國藥用動物志》〔21〕：“蜥蜴可以活血祛瘀。”其性寒，味咸，歸肺、肝、腎三經(jīng)，是血肉有情之軀，具有養(yǎng)血活血、消癭祛瘀散結(jié)的功效，能夠促進血液循環(huán)。主要見于寧夏地區(qū)，屬于草原荒漠蜥蜴。《本草綱目》記載，蜥蜴可“消水飲陰癀，滑竅破血”。研究表明，蜥蜴富含蛋白質(zhì)、多肽類、氨基酸和脂肪及鋁、鋇、鈣、鎘、鉻、銅、鈷、鐵、鎳、鎂、錳、鋅等多種微量元素，可以起到抗癌的作用，并能提高機體免疫力、促進胃黏膜再生修復。黃芪、白術(shù)、半枝蓮、延胡索、山楂、白芍為臣藥益氣養(yǎng)陰，和胃通絡(luò)、扶正抗癌；三七、鹿角膠為使藥，溫陽通絡(luò)，改善黏膜血液循環(huán)；甘草為佐，調(diào)和諸藥。各藥共用，補陰益氣、解毒通絡(luò)、增強免疫力、扶正抗癌。繆希雍《先醒齋醫(yī)學廣筆記》指出：“湯者，蕩也，去大病用之；散者，散也，去急病用之”。《臨證指南醫(yī)案》云：“細末者不循經(jīng)絡(luò)，止去胃中及臟腑之積。”基于此認識，本研究組成復方蜥蜴散粉碎成散劑顆粒，臨床應(yīng)用療效較好。

綜上，復方蜥蜴散解毒通絡(luò)通過增加黏膜血流，改善氧供，激活HIF-1α，介導PI3K/AKT信號通路，進而影響EMT相關(guān)蛋白表達，可有效促進腫瘤細胞凋亡，阻斷胃癌浸潤轉(zhuǎn)移，為臨床中醫(yī)藥抗癌應(yīng)用提供科學依據(jù)。