基于mTOR/S6K1信號通路研究下調miR-194-1對糖尿病腎病模型大鼠的干預作用

周密 楊麗 陳海濱 宋俊華 楊水生

(1長沙市第四醫院內分泌科，湖南 長沙 410000；2湖南省人民醫院)

糖尿病作為一種臨床較為常見的慢性疾病，其發生發展會誘發一系列的并發癥，嚴重威脅患者身體健康〔1〕。糖尿病腎病是較為常見的糖尿病并發癥〔2，3〕，老年人群為糖尿病腎病主要發病群體，近年來，我國每年新增糖尿病腎病病例數連年上升〔4，5〕。糖尿病腎病臨床治療難度較高，有些患者可能會進一步發展為終末期腎臟病，對患者生命安全造成威脅〔6，7〕。目前臨床醫學尚無特效的治療糖尿病腎病的手段，許多專家學者開始致力于糖尿病腎病新的治療靶點的研究〔8～10〕。本研究建立糖尿病腎病大鼠模型，靶向調控微小RNA-194-1(miR-194-1)表達，觀察效果。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性大鼠，由華蘭生物工程股份有限公司提供，8～10月齡，平均(9.0±0.8)月齡；體重218～243 g，平均體重(232.5±6.7)g。在相對濕度50%～55%、溫度(22.7±2.1)℃的環境中喂養1 w，光照12 h/d。主要試劑：大鼠抗小鼠miR-194-1抗體(Gibco公司)；小鼠抗大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)抗體(Dako公司)；大鼠抗小鼠過氧化氫酶(CAT)、終末氧化蛋白產物(AOPP)抗體(Selleck公司)；兔抗小鼠白細胞介素(IL)-6、IL-1β抗體(Sigma公司)；小鼠抗兔磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)抗體(Invitrogen公司)；小鼠抗兔磷酸化核糖體40S小亞基S6蛋白激酶(p-S6K1)抗體(Hyclone公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組 隨機選取10只大鼠為正常組，不做處理。其余30只建立糖尿病腎病模型：隔夜禁食16 h，對30只建模大鼠一次性腹腔注射60 mg/kg STZ。5 d后檢測大鼠血糖，血糖>16.7 mmol/L、尿糖、尿蛋白陽性視為糖尿病腎病模型建立成功。共建模成功27只，將27只糖尿病腎病模型大鼠隨機分為模型組、上調miR-194-1組、下調miR-194-1組各9只。下調miR-194-1組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg antagomiR-194-1，上調miR-194-1組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg agomiR-194-1，正常組、模型組大鼠尾部靜脈注射等量生理鹽水。

1.2.2空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平檢測 取各組大鼠腹部靜脈血3 ml，2 000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80℃環境中保存待檢。血糖檢測儀檢測FBG、HbA1c水平。CHOD-PAP法檢測TC水平，GPO-PAP法檢測TG水平，檢測過程按照TC單試劑測定試劑盒、TG檢測試劑盒操作說明書進行。

1.2.3miR-194-1表達檢測 RT-PCR檢測miR-194-1表達。Trizol法提取細胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉錄處理后獲得cDNA，采用Primer 5.0軟件設計引物序列，2-ΔΔCt方法計算miR-194-1表達，內參U6。

1.2.4腎重指數檢測、腎組織蘇木素-伊紅(HE)染色 稱量、記錄各組大鼠體重，麻醉后頸椎脫臼法處死，取腎組織稱重，對腎重指數進行計算。將大鼠腎組織固定在4%甲醛中，完全浸泡，1 d后常規石蠟包埋、切片。切片脫蠟、脫水處理后梯度酒精復水3 min，蘇木素染色，清洗后分化、酒精脫水，伊紅染色后再次梯度酒精脫水，封片后顯微鏡觀察。

1.2.5酶聯免疫吸附試驗檢測SCr、BUN、IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平 設定1空白孔、10標準孔，標本稀釋后封板，37℃培養箱靜置0.5 h后充分洗板，拍干后個孔添加50 μl酶標液(空白孔除外)，封膜孵育0.5 h后洗板，拍干后各孔添加50 μl顯色A液、B液并搖晃均勻，室內遮光靜置20 min，添加50 μl終止液，450 nm波長測吸光度，檢測SCr、BUN、IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平。

1.2.6Western印跡檢測p-mTOR、p-S6K1相對表達量 提取50 μg蛋白煮沸變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉膜、封閉(室內1.5 h)，添加一抗(1∶2 000)后孵育1 d，次日Western液充分清洗后添加二抗(1∶5 000)進行孵育，1 h后再次使用Western液清洗，顯色、曝光、成像后檢測條帶灰度值，檢測p-mTOR、p-S6K1相對表達量。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組腎組織病理圖HE染色 如圖1所示，正常組腎組織細胞大小平均，形態規則；模型組、上調miR-194-1組腎組織細胞大小、形態均不規則，腎小球結構受損，且細胞排列較為雜亂；下調miR-194-1組腎組織細胞結構較為完整，細胞大小、形態較規則，細胞排列較為整齊。

圖1 各組腎組織病理HE染色(×400)

2.2各組miR-194-1表達比較 如表1所示，與正常組比較，其他3組miR-194-1表達較高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組、上調miR-194-1組比較，下調miR-194-1組miR-194-1表達較低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3各組FBG、HbA1c、TC、TG水平比較 如表1所示，與正常組比較，其他3組FBG、HbA1c、TC、TG水平較高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組、上調miR-194-1組比較，下調miR-194-1組FBG、HbA1c、TC、TG水平較低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4各組腎重指數、SCr、BUN水平比較 如表2所示，與正常組比較，其他3組腎重指數、SCr、BUN水平較高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組、上調miR-194-1組比較，下調miR-194-1組腎重指數、SCr、BUN水平較低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組miR-194-1表達及FBG、HbA1c、TC、TG水平比較

表2 各組腎重指數、SCr、BUN水平比較

2.5各組IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平比較 如表3所示，與正常組比較，其他3組IL-6、IL-1β、AOPP水平較高，CAT水平較低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組、上調miR-194-1組比較，下調miR-194-1組IL-6、IL-1β、AOPP水平較低，CAT水平較高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平及p-mTOR、p-S6K1相對表達量比較

2.6各組p-mTOR、p-S6K1相對表達量比較 如表3、圖2所示，與正常組比較，其他3組p-mTOR、p-S6K1相對表達量較高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組、上調miR-194-1組比較，下調miR-194-1組p-mTOR、p-S6K1相對表達量較低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

1～4：正常組、模型組、上調miR-194-1組、下調miR-194-1組圖2 各組p-mTOR、p-S6K1表達

3 討 論

微小RNA(miRNA)在大多數生物中大量存在，miR-194-1為miRNA家族的重要組成部分，在糖尿病腎病中呈現異常高表達〔11～13〕。糖尿病腎病發生主要原因為機體異常、持續的高血糖狀態，并且其不斷發展還會導致機體血脂水平異常〔14,15〕。本文研究結果說明，糖尿病腎病的發生發展伴隨著血糖、血脂水平異常，下調miR-194-1表達能夠有效抑制糖尿病腎病模型大鼠血糖、血脂水平，從而發揮干預效果。糖尿病腎病的發生發展會對機體腎功能造成嚴重的威脅〔16,17〕。SCr、BUN是臨床常用的評價機體腎功能損傷狀況的指標。彭靜〔18〕通過動物實驗表示，糖尿病腎病的發生發展會使動物模型腎重指數明顯上升，造成較為嚴重的腎臟損傷。本文研究結果說明，糖尿病腎病的發生發展導致腎重指數上升及機體腎功能損傷，下調miR-194-1表達能夠改善大鼠腎重指數，使糖尿病腎病大鼠腎功能得到有效提升。

糖尿病腎病的發生發展伴隨著機體腎臟組織炎癥反應、氧化應激反應〔19,20〕。IL-6、IL-1β是常用的評價機體炎癥反應的指標，二者水平變化與機體炎癥反應密切相關。CAT是機體防御系統匯總的重要酶類清除劑，能夠清除過氧化氫，減輕細胞損傷。AOPP是常用的體現機體氧化應激反應嚴重程度的產物。本文研究結果說明，下調miR-194-1表達能夠有效減輕糖尿病腎病大鼠腎臟組織炎癥反應、氧化應激損傷嚴重程度，從而起到腎臟保護作用。

有研究表示，mTOR/S6K1信號通路在糖尿病腎病發生發展過程中起到重要作用〔21〕。mTOR/S6K1通路蛋白表達變化與機體腎組織細胞損傷、自噬具有密切聯系，本文研究結果顯示，糖尿病腎病模型大鼠p-mTOR、p-S6K1表達較高，下調miR-194-1表達的糖尿病腎病大鼠p-mTOR、p-S6K1表達下調，可能是因為下調miR-194-1表達能夠靶向調控mTOR/S6K1信號通路，抑制p-mTOR、p-S6K1表達，從而起到改善糖尿病腎病大鼠腎組織細胞自噬活性、減輕腎組織損傷的作用。

綜上所述，下調糖尿病腎病模型大鼠miR-194-1表達，能夠改善大鼠血糖、血脂水平，改善糖尿病腎病模型大鼠腎臟病變狀況及腎功能，減輕炎癥反應、氧化應激損傷嚴重程度，發揮腎臟保護作用，出現這一干預效果可能是由于下調miR-194-1表達能夠靶向調控mTOR/S6K1信號通路，從而起到減輕腎組織損傷的作用，為糖尿病腎病的臨床治療提供了新的研究方向。