沉默RORα通過活化Wnt/β-catenin通路靶基因促進人胃癌細胞增殖

裴大兵 張翼臻 劉芳 蘇堅,3 夏紅 蘇琦

(1南華大學衡陽醫學院腫瘤研究所 湖南省腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室 湖南省胃癌研究中心，湖南 衡陽 421001；2井岡山大學附屬醫院普外科；3南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院病理科)

胃癌全球發生率與死亡率分別居于惡性腫瘤第五位與第三位，其中約44%的胃癌發生在中國〔1,2〕。因為胃癌早期發現困難，中晚期患者常常侵襲轉移，治療效果較差，5年生存率低〔2〕。因此，探討胃癌侵襲轉移機制是非常關鍵的問題。維甲酸相關孤核受體(RORs)的家族成員之一RORα，在多種腫瘤中低表達與腫瘤密切相關，并且可能是乳腺癌、黑色素瘤、結直腸癌和胃癌等腫瘤的靶點〔3〕。RORα高表達可抑制人胃癌MGC803細胞Wnt/β-連環素(catenin)信號通路靶基因表達〔4〕。并且，沉默RORα可促進人胃癌細胞上皮細胞-間充質轉化(EMT)〔5〕。本文研究敲低RORα是否促進胃癌細胞Wnt信號通路靶基因表達。

1 材料與方法

1.1抗體與主要試劑 二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、RNA提取試劑盒與逆轉錄試劑盒(Promega公司)；RORα抗體、基質金屬蛋白酶(MMP)-9抗體與β-actin抗體(Abcam公司)；β-catenin、p-β-catenin、Wnt-1、轉錄因子(TCF)-4、Axin、c-Jun、c-Myc抗體與電化學發光(ECL)試劑盒(Santa Cruz公司)；細胞核蛋白和胞質蛋白提取試劑盒、羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)和羊抗小鼠IgG-HRP(凱基生物公司)；免疫共沉淀試劑盒(Pierce公司)；羊抗小鼠IgG(H+L)(protech生物公司)；c-Myc-pGL-3熒光素酶報告質粒由廣州賽業生物公司提供。新生牛血清(杭州四季青生物公司)；引物由上海生工公司合成。

1.2細胞培養 人胃癌MGC803細胞系(胃低分化黏液癌細胞)由中南大學腫瘤研究所饋贈，沉默RORα的MGC803細胞由本實驗室構建〔5〕。在加入10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(青霉素/鏈霉素)的RPMI1640中培養。分為MGC803組、空載體組和RORα敲低組。

1.3噻唑藍(MTT)檢測檢測沉默RORα對MGC803細胞增殖的作用 將對數生長期MGC803細胞，胰酶消化制成單細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔設6個重復孔。細胞貼壁8 h后，更換為RPMI1640培養液，每孔加入MTT溶液，培養4 h，吸去全部上清液，再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液，振蕩搖勻，使結晶充分溶解。置酶聯免疫儀檢測各孔吸光值，波長光密度(OD570 nm)。

1.4實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測Wnt/β-catenin通路相關分子 采用試劑盒提取細胞總RNA，AMV 酶逆轉錄合成 cDNA，PCR引物序列：RORα正義：5′-GTCAGCAGCTTCTACCTGGAC-3'、反義：5′-CAGTTGGGGAAGTCTCGCCG-3′，151 bp。Wnt1正義：5′-TGCACGCACACGCGCGTACTGCAC-3′、反義：5′-CAGGATGGCAAGAGGGTTCATG-3′，400 bp。β-catenin正義：5′-GTTGTACCGGAGCCCTTCAC-3′、反義：5′-TCCCACCCTACCAACCAAGT-3′，729 bp。Axin正義：5′-AGCCGTGTCGGACATGGA-3′、反義：5′-CCTCAAACACCACCCCACAG-3′，254 bp。c-Myc正義：5′-CGTCTCCACACATCAGCACAA-3′、反義：5′-CTGCTTGGACGGACAGGATG-3′，323 bp。c-Jun正義：5′-CGCACCGGTTGTTGAACTTG-3′、反義：5′-ATGCCTCCCGCACTCTTACT-3′，292 bp。MMP-9正義：5′-GTGCTGGGCTGCTGCTTTGCTG-3′、反義：5′-TGGGGTTCGCATGGCCTTCA-3′，255 bp。β-actin正義：5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3′、反義：5′-GGAACCGCTCATTGCCAATG-3′，498 bp。PCR與文獻相同〔4〕。

1.5Western印跡檢測Wnt/β-catenin通路相關分子 收集細胞，加入細胞裂解液，在冰上通過裂解液徹底裂解1 h后低溫離心收集細胞蛋白，利用BCA試劑盒測取蛋白濃度，經過上樣緩沖液高溫變形后，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜。脫脂牛奶封閉2 h，TBST清洗后加一抗4 ℃孵育過夜。TBST清洗后二抗孵育1 h，通過ECL獲得結果。

1.6免疫共沉淀 按照免疫共沉淀試劑盒說明書收集樣本蛋白。將RORα抗體加入細胞裂解物，4℃過夜，加入含蛋白G的旋轉柱上，孵育30 min，2 000 r/min離心3 min，棄去濾過液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加洗脫液洗2次，獲得抗體復合物，加上樣緩沖液，SDS-PAGE，進行Western印跡。

1.7熒光素酶報告基因分析 制備單細胞懸液,細胞計數,以3×104/cm2的細胞數量種入24孔板，c-Myc-pGL-3英光素酶報告質粒用脂質體(Lipofectamine)2000轉染入細胞。加入裂解液，離心，加入熒光素酶底物。采用液體閃爍儀檢測熒光值，相對熒光素酶活性=熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.8統計學分析 采用SPSS13統計軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1MTT檢測 48 h后，RORα敲低組增殖能力較MGC803組和空載體組(miR/MGC803)明顯增強(P<0.05)。見表1。表明敲低RORα可促進MGC803細胞增殖能力。

2.2沉默RORα對Wnt/β-catenin通路的影響 RORα敲低組Wnt1 mRNA(2.90±0.3)較MGC803組(0.71±0.3)與空載體組(0.81±0.2)顯著上調(P<0.05)；RORα敲低組Wnt1蛋白(1.15±0.31)較MG803組(0.65±0.32)與空載體組(0.70±0.10)顯著上調(P<0.05)。但RORα敲低組(1.06±0.31)、MGC803組(1.13±0.28)、空載體組總β-catenin蛋白(1.18±0.25)與RORα敲低組(1.17±0.31)、MGC803組(0.96±0.52)、空載體組β-catenin mRNA(1.18±0.25)沒有顯著差異(P>0.05)。見圖1。免疫共沉淀顯示，RORα敲低組(0.42±0.21)較MGC803組(1.53±0.50)與空載體組RORα與β-catenin結合(1.62±0.51)明顯減少(P<0.05)。見圖2。Western印跡檢測顯示，RORα敲低組(0.32±0.25)較MGC803組(0.18±0.18)與空載體組核內β-catenin(0.19±0.20)顯著增加(P<0.05)。見圖3。并且RORα敲低組TCF-4蛋白(1.42±0.53)較MGC803組(0.63±0.42)與空載體組(0.67±0.34)明顯上調(P<0.05)。見圖4。表明沉默RORα可上調Wnt1，與β-catenin結合減少，從而增加β-catenin入核，繼而上調TCF-4表達。

表1 沉默RORα對MGC803細胞增殖的 影響

1:MGC803組;2:空載體組;3:RORα敲低組；圖3、4、5同圖1 沉默RORα對MGC803細胞Wnt1、 β-catenin表達的影響

1:IgG;2:MGC803組;3:空載體組;4:RORα敲低組圖2 免疫共沉淀檢測沉默RORα對MGC803細胞 RORα與β-catenin結合的影響

圖3 沉默RORα對核內β-catenin表達的影響

圖4 沉默RORα對MGC803細胞TCF-4蛋白表達的影響

2.3沉默RORα促進Wnt/β-catenin通路靶基因表達 RORα敲低組較MGC803組、空載體組c-Myc、c-Jun、Axin、MMP-9 mRNA與蛋白表達明顯上調(P<0.05)，見圖5，表2；提示沉默RORα可促進Wnt/β-catenin通路靶基因表達。

2.4沉默RORα增強c-Myc啟動子活性 MGC803組(1 500±0.98)與空載體組c-Myc啟動子活性(1 497±0.78)明顯低于RORα敲低組(2 536±0.59，P<0.05)。提示敲低RORα能夠增強c-Myc啟動子活性。

表2 沉默RORα對MGC803細胞Wnt/β-catenin通路靶基因mRNA及蛋白表達的影響

3 討 論

既往研究發現，RORα在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)表達明顯低于正常上皮細胞，并且與分化程度、臨床分期和不良生存率明顯有關。沉默RORα可促進OSCC細胞增殖與裸鼠移植瘤生長，下調p53表達與抑制p53磷酸化。相反，RORα高表達可明顯抑制增殖與移植瘤生長，上調p53與磷酸化水平〔6〕。在紫外線誘導的皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)小鼠模型中，發現RORα下調，轉錄組分析、生物信息學分析和細胞實驗證明RORα是cSCC進展過程中的關鍵轉錄因子。并且，RORα通過下調S100a9和Sprr2f表達，進而抑制cSCC細胞增殖和遷移〔7〕。研究顯示，食管癌組織與細胞中，較正常組織與細胞RORα明顯下調，并且發現RORα基因啟動子區域被甲基化。采用甲基化抑制劑5aza-2-dc處理后，RORα mRNA與蛋白表達上調，而RORα高表達或激活可抑制腫瘤細胞增殖〔8〕。ROR-α-1高表達可顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并下調β-catenin、c-Myc、CyclinD1和N-cadherin水平，提示ROR-α-1具有抑制肝癌的作用〔9〕。

研究證實，Wnt/β-catenin信號通路在胃癌進展中起重要作用〔10〕。Wnt/β-catenin信號轉導中的關鍵因子及其下游效應因子在腫瘤起始、生長、轉移和治療耐藥性中的調節過程中發揮作用〔11〕。wnt/β-catenin通路的失調常誘發EMT，導致癌細胞失去上皮表型而獲得間充質表型的過程，促進腫瘤遷移和侵襲，可能是腫瘤治療靶點〔12,13〕。有學者報道，在乳腺癌中RORα低表達，而促進其高表達后，可通過與β-catenin結合下調Wnt/β-catenin 靶基因表達，抑制乳腺癌細胞增殖與侵襲，提示RORα可通過下調Wnt/β-catenin靶基因抑制乳腺癌進展〔14〕。不僅如此，PGE2/蛋白激酶(PK)Cα可磷酸化RORα，從而抑制Wnt信號通路下游基因CyclinD1的轉錄表達，表明RORα是調控腫瘤細胞增殖的關鍵因子〔15〕。miR-1246在肝癌中高表達，其靶基因是RORα，miR-1246高表達和RORα低表達是侵襲性肝癌的顯著特征。miR-1246高表達或沉默RORα可通過激活Wnt/β-catenin通路在體內外增強肝癌的增殖、侵襲與轉移和促進EMT〔16〕。RORα在胃癌中低表達與腫瘤大小、腫瘤分化、TNM分期和淋巴結轉移顯著有關，其機制是由于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性降低，而AMPK可通過轉錄與翻譯后修飾調控RORα。研究報告，AMPK活化劑AICAR可增強RORα活性與表達，上調p21、SEMA3F等抑癌基因表達。表明AMPK的活化劑可能對治療胃癌具有價值〔17〕。

結果表明RORα可能是胃癌治療的靶點。目前，研發RORα的激動劑或有效藥物成為治療腫瘤的新策略〔14〕。研究表明，姜黃素是一種可以抑制Wnt/β-catenin通路，并減緩胃癌發展進程的傳統中藥單體〔18〕。綠茶中的多酚EGCG也可以通過失活Wnt/β-catenin通路，從而抑制胃癌細胞的增殖生長，并促進其凋亡來抑制胃癌發展〔19〕。研究指出，亞硒酸鈉可通過增強SBP1表達來抑制Nrf2和Wnt/β-catenin通路的活性，從而阻礙癌細胞增殖和生長〔20〕。類似的，吳茱萸堿(Evodiamine)可通過干預Wnt/β-catenin通路活性，抑制Sox2、KLF4、Bmi1和Oct4的表達，進而抑制胃癌干細胞的特征從而下調奧沙利鉑耐藥，并且還可抑制Slug、Twist、Zeb1和Vimentin的水平，逆轉EMT進程〔21〕。維生素D羥基衍生物20(OH)D3和1,20(OH)2D3可通過失活Wnt/β-catenin信號通路下調β-catenin核易位抑制OSCC CAL-27的生長〔22〕。并且，維生素D羥基衍生物和RORα激動劑SR1078可抑制卵巢癌的增殖和干性〔23〕。SR1078可通過上調RORα表達抑制人胃癌細胞的增殖和侵襲〔24〕。

研究顯示，二烯丙基二硫(DADS)是來自大蒜中的一種脂溶性烯丙基硫化物有效成分，在多種腫瘤中都具有明顯的抗癌作用〔25〕。DADS可通過抑制Rac1-Pak1/Rock1/LIMK1通路來阻礙胃癌細胞的EMT〔26〕。在蛋白質組學中，DADS可促進人胃癌MGC803細胞中RORα表達〔27〕。然而，DADS是否也可通過RORα導致Wnt/β-catenin通路失活，從而作為胃癌治療的潛在靶點尚待深入研究。