CircRNA Hipk1調控miR-146a-5p/Notch2軸對缺血性心律失常大鼠心肌細胞凋亡的影響

郭 亮，李亞潔

缺血性心律失常是心肌梗死病人常見的并發癥，可減少病人冠狀動脈血流量，促進心肌缺血進展，加重心肌損傷，是導致病人猝死的主要原因之一，因此，防治缺血性心律失常對提高冠心病等心血管疾病病人生活質量和存活率具有重要的臨床意義[1-2]。炎癥參與介導缺血性心律失常的發病過程，并促進其進展，使用抗炎藥物可改善心肌缺血引發的心律失常癥狀[3-4]。miR-146a-5p是一種具有顯著抗炎作用的微小RNA，參與介導哮喘、慢性阻塞性肺疾病、心律失常等炎性疾病的發生發展過程，過表達miR-146a通過阻止核轉錄因子-κB(NF-κB)信號激活抑制炎癥[5]，且miR-146a-5p可作為心房顫動的生物標志物，經藥物治療后其血漿水平升高[6]，Notch2是其靶基因。有研究表明，miR-146a-5p可直接靶向下調Notch2表達，進而保護心肌細胞免受缺氧/復氧損傷[7-8]，提示miR-146a-5p/Notch2可作為缺血性心律失常的重要治療靶點。Hipk1是一種環狀RNA，可調控炎癥發生及進展，下調Hipk1表達可減少炎性因子表達分泌，抑制炎癥，抑制宮頸炎進展[9]，同時促進心肌細胞生長和增殖，改善心肌缺血損傷后不良心臟重塑和心功能障礙[10]，因而推測干擾CircRNA Hipk1可能對缺血性心律失常具有治療作用。本研究建立缺血性心律失常大鼠模型，探討CircRNA Hipk1調控miR-146a-5p/Notch2軸對缺血性心律失常大鼠心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠購自遼寧長生生物技術股份有限公司[SCXK(遼)2020-0001]，質量合格證號No.210726200100192861，體質量(200±20)g，無特定病原體(SPF)級，雄性，參照《中華人民共和國實驗動物管理條例》于我院實驗動物中心飼養，分籠飼養，每籠8只，照明12 h/12 h晝夜節律，食水充足，通風良好，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%。

1.1.2 實驗試劑與儀器 Hipk1、miR-146a-5p、U6、Notch2及GAPDH引物、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒、miR-146a-5p Antagomir、CircRNA Hipk1 siRNA陰性對照腺相關病毒、miR-146a-5p Antagomir陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(D025-1-1)、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)染色檢測試劑盒(G001-1-1)、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(D006-1-1)、大鼠白細胞介素(IL)-17測試盒(H014-1)、大鼠IL-1β測試盒(H002)、TRIzol總RNA提取試劑(N065)、一步法逆轉錄實時定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)試劑盒(N123)購自南京建成生物工程研究所有限公司。

小動物呼吸機(Kent)購自肯特企業集團公司；生物機能實驗系統(BL-420F)購自成都泰盟軟件有限公司；酶標儀(PT-DR200B)購自北京普天新橋技術有限公司；倒置顯微鏡(IX51)購自日本OlymPus公司；冰凍切片機(CM1950)購自德國Leica公司；RT-qPCR儀(Roche Light Cycler480 Ⅱ)購自瑞士羅氏公司等。

1.2 方法

1.2.1 制備缺血性心律失常大鼠模型及分組給藥 SD大鼠禁食12 h后腹腔注射60 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，參照文獻[11]制備缺血性心律失常模型：仰臥固定后氣管插管，采用小動物呼吸機進行機械通氣(呼吸頻率70次/min，潮氣量6～7 mL)，將大鼠四肢皮下連接到生物機能實驗系統，隨時觀察心電變化，大鼠前胸備皮消毒，開胸暴露心臟，鈍性分離肺動脈并結扎，觀察到結扎線下左心室前壁出現發紺，且標準Ⅱ導聯心電圖ST段抬高，表明心肌缺血成功，0.5 h后，放開結扎線，恢復血流灌注2 h，即完成造模。將大鼠隨機分為模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒(干擾CircRNA Hipk1)組、miR-146a-5p Antagomir(miR-146a-5p抑制劑)組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組、陰性對照(CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒陰性對照+miR-146a-5p Antagomir陰性對照)組，每組12只；另外隨機選擇12只大鼠，僅開胸暴露心臟，不結扎肺動脈，作為假手術組。

將購買的RNA抑制劑及陰性對照溶解于生理鹽水，配制成8 mg/mL的CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒藥液、8 mg/mL的miR-146a-5p Antagomir藥液、8 mg/mL的CircRNA Hipk1 siRNA陰性對照腺相關病毒藥液、8 mg/mL的miR-146a-5p Antagomir陰性對照藥液、8 mg/mL的CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒藥液和8 mg/mL的miR-146a-5p Antagomir混合藥液、8 mg/mL的CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒陰性對照藥液和8 mg/mL的miR-146a-5p Antagomir陰性對照混合藥液，參照文獻[12]及說明書，藥物干預組大鼠均于放開結扎線前5 min，分組尾靜脈注射10 mL/kg劑量的藥液，間隔1 d后，再次注射，共注射3次，假手術組和模型組以相同方法注射等量生理鹽水。

1.2.2 測定大鼠心律失常癥狀 藥物干預后24 h，采用生物機能實驗系統記錄大鼠心電圖并進行分析，根據室性期前收縮(ventricular premature beat，VP)、非持續性室性心動過速(nonsustained VT，NSVT)、室性心動過速(ventricular tachycardia，VT)、房室傳導阻滯(atrioventricular block，AVB)等心律失常癥狀發生情況進行心律失常評分，評分標準：無心律失常計0分，單個VP計1分，2個VP計2分，3個VP或NSVT計3分，VT或AVB計4分，死亡計5分。

1.2.3 測量大鼠心肌梗死面積及標本采集 心律失常評分完成后，參照1.2.1方法采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，使用注射器刺入頸動脈采集血液約1.2 mL，離心(4 ℃，15 min，3 000 r/min)，吸出上清并得到血清，保存于-80 ℃冰箱中；斷頭處死大鼠，解剖取出心臟，每組隨機選取6只大鼠心臟，清洗后，剪下約0.8 g心肌組織并保存于液氮中，剩余心肌組織置于包埋劑中，使用液氮快速冷凍，再用冰凍切片機進行連續病理切片備用；每組剩余6只大鼠心臟沿左心室長軸方向切成厚約2 mm薄片，浸入TTC染液中，37 ℃下孵育30 min，之后以4%多聚甲醛固定24 h，取出后采用Image J軟件分析計算，心肌梗死面積=心肌損傷面積/總心肌面積×100%。

1.2.4 觀察大鼠心肌組織病理形態及心肌細胞凋亡 取出1.2.3中的心肌組織冰凍切片，室溫下復溫15 min，以冰丙酮固定，各取出3張，分別使用試劑盒進行HE及TUNEL染色，具體步驟參照說明書進行，之后分別以蒸餾水漂洗后，鋪在載玻片上，封片后以顯微鏡觀察，任意選出每張切片上5個視野拍照，以Image J軟件分析計算，心肌細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.5 測定血清IL-1β、IL-17水平 取出1.2.3中大鼠血清，置于冰水浴中提前解凍，采用相應試劑盒檢測血清IL-1β、IL-17水平，具體步驟按照試劑盒說明進行。

1.2.6 測定大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、miR-146a-5p及Notch2 mRNA表達水平 取出1.2.3中大鼠心肌組織，采用TRIzol提取其中總RNA后通過試劑盒進行RT-qPCR反應，具體步驟按照試劑盒說明進行，反應體系為20 μL，方法按照試劑盒說明書進行，反應條件：預變性(95 ℃)3 min，變性(95 ℃)12 s，退火(62 ℃)40 s，40個循環，通過2-ΔΔCt法分析數據，采用相對定量法，以U6作為miR-146a-5p的內參，以GAPDH作為CircRNA Hipk1及Notch2 mRNA的內參，檢測CircRNA Hipk1、miR-146a-5p及Notch2 mRNA相對表達水平，各基因擴增引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠心律失常評分比較 與假手術組比較，模型組大鼠心律失常評分升高(P<0.05)；與模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組比較，CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒組大鼠心律失常評分降低(P<0.05)，miR-146a-5p Antagomir組大鼠心律失常評分升高(P<0.05)；陰性對照組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組與與模型組大鼠心律失常評分比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心律失常評分比較(±s) 單位：分

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死面積增大(P<0.05)；與模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組比較，CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒組大鼠心肌梗死面積減小(P<0.05)，miR-146a-5p Antagomir組大鼠心肌梗死面積增大(P<0.05)；陰性對照組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組與模型組大鼠心肌梗死面積比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3、圖1。

表3 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s) 單位：%

圖1 TTC染色測定大鼠心肌梗死大體情況(A為假手術組；B為模型組；C為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒組；D為miR-146a-5p Antagomir組；E為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組；F為陰性對照組)

2.3 各組大鼠心肌組織病理形態結果比較 假手術組大鼠心肌組織無明顯損傷；模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組、陰性對照組大鼠心肌組織結構紊亂，細胞輪廓不清，排列紊亂，有炎癥細胞浸潤，呈明顯損傷；CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒組大鼠心肌組織相關病理損傷減輕；miR-146a-5p Antagomir組大鼠心肌組織上述病理損傷加重。詳見圖2。

圖2 HE染色測定大鼠心肌組織病理形態(A為假手術組；B為模型組；C為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒組；D為miR-146a-5p Antagomir組；E為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組；F為陰性對照組)

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組比較，CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒組大鼠心肌細胞凋亡率降低(P<0.05)，miR-146a-5p Antagomir組大鼠心肌細胞凋亡率升高(P<0.05)；陰性對照組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組與模型組大鼠心肌細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 TUNEL染色測定大鼠心肌細胞凋亡情況(A為假手術組；B為模型組；C為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒組；D為miR-146a-5p Antagomir組；E為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組；F為陰性對照組)

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較(±s) 單位：%

2.5 各組大鼠血清IL-1β、IL-17水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-17水平升高(P<0.05)；與模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組比較，CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒組大鼠血清IL-1β、IL-17水平降低(P<0.05)，miR-146a-5p Antagomir組大鼠血清IL-1β、IL-17水平升高(P<0.05)；陰性對照組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組大鼠與模型組血清IL-1β、IL-17水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠血清IL-1β、IL-17水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.6 各組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、miR-146a-5p及Notch2 mRNA水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、Notch2 mRNA表達水平升高(P<0.05)，miR-146a-5p mRNA表達水平降低(P<0.05)。與模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組比較，CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、Notch2 mRNA表達水平降低(P<0.05)，miR-146a-5p mRNA表達水平升高(P<0.05)；miR-146a-5p Antagomir組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、Notch2 mRNA表達水平升高(P<0.05)，miR-146a-5p mRNA表達水平降低(P<0.05)。陰性對照組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒+miR-146a-5p Antagomir組與模型組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、miR-146a-5p及Notch2 mRNA表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表6。

表6 各組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、miR-146a-5p及Notch2 mRNA表達水平比較(±s)

3 討 論

心律失常作為冠心病、急性心肌梗死等心血管疾病的常見并發癥，是導致心源性猝死的主要原因，心律失常的防治一直是臨床工作的難點和重點。有研究表明，心肌梗死面積越大，心律失常癥狀越嚴重，因此，減輕急性心肌缺血后損傷對改善心律失常癥狀至關重要[13-14]。本研究通過結扎肺動脈方法建立缺血性心律失常模型，結果顯示，造模大鼠心律失常評分、心肌梗死面積、心肌細胞凋亡率、血清IL-1β與IL-17水平升高，且心肌組織結構紊亂，細胞輪廓不清，排列紊亂，有炎性細胞浸潤，呈明顯損傷，表明心肌缺血再灌注后炎性細胞因子大量產生，引發強烈的心肌炎癥，造成心肌細胞凋亡，損害心肌組織，導致心律失常，提示模型構建成功。

炎癥反應在心律失常發生及病情進展過程中發揮著關鍵的作用，抑制炎癥的發生發展，可減輕心肌缺血損傷，改善心律失常癥狀[15-16]。Hipk1是一種參與調控炎癥和過氧化反應的環狀RNA，下調其表達，可減輕炎癥，改善急性呼吸窘迫綜合征小鼠肺損傷，同時減少心肌缺血引發的心肌細胞凋亡，緩解心臟不良重塑，改善心功能障礙[10，17]，提示Hipk1可作為防治缺血性心律失常的一個潛在作用靶點。本研究結果顯示，以CircRNA Hipk1 siRNA腺相關病毒處理缺血性心律失常大鼠，可減輕心肌組織病理損傷，減小心肌梗死面積，降低心律失常評分、心肌細胞凋亡率、血清IL-1β與IL-17水平，表明下調CircRNA Hipk1表達，可減小心肌梗死面積，抑制心肌缺血引發的炎性因子過度表達，減輕心肌炎癥損傷，減少心肌細胞凋亡，改善大鼠心律失常癥狀。

miR-146a-5p作為一種有較強抗炎活性的微小RNA，在心肌缺血損傷過程中發揮重要的調控作用，促進其表達，可降低活性氧過度釋放，減輕心肌炎癥，抑制心肌細胞凋亡，保護心功能[18]。Notch2作為其靶基因[7]，可調控氧糖剝奪引發的嚴重及氧化應激反應，下調Notch2表達，可阻礙炎癥發生發展，保護神經細胞免受氧糖剝奪誘導的損傷[19]，同時抑制內皮間質轉化，減輕高糖誘導的心肌纖維化[20]，緩解缺氧/復氧導致的心肌細胞損傷[8]，因此，miR-146a-5p/Notch2可作為防治缺血性心律失常的一個重要靶點。本研究結果顯示，以miR-146a-5p Antagomir下調缺血性心律失常大鼠miR-146a-5p表達，可加重心肌組織病理損傷，增大心肌梗死面積，升高心律失常評分、心肌細胞凋亡率、血清IL-1β與IL-17水平、心肌組織Notch2 mRNA表達水平，表明miR-146a-5p/Notch2參與介導缺血性心律失常的發生發展過程，下調Hipk1表達，可升高miR-146a-5p表達水平，且miR-146a-5p Antagomir可減弱干擾CircRNA Hipk1表達對缺血性心律失常大鼠心肌炎癥損傷及心律失常癥狀的改善作用，逆轉對心肌細胞凋亡的抑制作用，表明下調CircRNA Hipk1表達可促進miR-146a-5p表達，降低Notch2表達，減輕心肌炎癥，緩解缺血性心律失常大鼠心肌細胞凋亡及心律失常癥狀。

綜上所述，CircRNA Hipk1參與介導缺血性心律失常的發病及進展過程，下調其表達，可上調miR-146a-5p表達，降低Notch2表達，阻礙炎癥發生發展，減輕心肌病理損傷，抑制心肌細胞凋亡，改善心肌梗死及心律失常癥狀，調節miR-146a-5p/Notch2信號傳導是其發揮抗心律失常作用的分子機制，本研究為缺血性心律失常的臨床治療提供了新靶點。