BAIAP2 mRNA在注意缺陷多動障礙患兒中的表達及臨床意義

章素芬，胡幼芳

注意缺陷多動障礙(attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)是以注意缺陷、多動及沖動為主的神經發育障礙性疾病，兒童期較常見。流行病學資料顯示，全球ADHD發病率為7.2%，我國ADHD患病率為5.6%[1-2]，這不僅導致兒童注意缺陷、認知障礙，影響兒童早期智力發展，同時約60%的病人ADHD癥狀持續至成年期，且ADHD亦是青春期和成年期社交障礙和犯罪的重要危險因素[3]。腦特異性血管發生抑制劑1相關蛋白2(brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2，BAIAP2)基因位于人類染色體17q25.3，在大腦皮層中高度富集，參與神經元的再生和成熟[4]。相關研究表明，大腦半球不對稱表達的BAIAP2與ADHD存在聯系，且BAIAP2基因多態性與兒童ADHD發病相關，提示BAIAP2可能參與ADHD的發病過程[5-6]。BAIAP2在ADHD患兒中的表達及臨床意義尚未明確。BAIAP2通過調控樹突棘形態和密度參與突觸可塑性改變[7]，然而BAIAP2能否通過調控突觸可塑性參與ADHD的發生尚未明確。本研究旨在分析BAIAP2 mRNA在臨床ADHD患兒中的表達及臨床意義，通過構建動物模型探討BAIAP2 mRNA調控ADHD癥狀的潛在作用機制，以期為闡明ADHD的發病機制及臨床診療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年7月—2021年7月在江蘇省人民醫院婦幼保健分院確診的60例ADHD兒童作為ADHD組，其中男36例，女24例，年齡5～13(8.57±2.20)歲。同時納入同期我院健康體檢的健康兒童40名為對照組，其中男24名，女16名，年齡5～13(8.48±1.93)歲。ADHD納入標準：所有患兒均符合《中國注意缺陷多動障礙防治指南》第二版[8]中ADHD診斷標準；首次就診且近6個月內未服用任何抗精神藥物；經頭顱MRI或CT檢查證實不存在任何腦組織缺損或缺血；韋氏幼兒智力量表第4版(WISC-Ⅳ)[9]測試智商>70分；視力及聽力正常；所有患兒家屬知情同意并簽署知情同意書。排除標準：既往存在或合并精神疾病史、精神疾病藥物治療史；合并慢性感染性、代謝性或免疫性疾病；存在家族精神遺傳病；無法配合治療和隨訪。本研究經江蘇省人民醫院倫理委員會審查并批準通過。

1.2 臨床研究方法

1.2.1 一般資料收集 記錄研究對象年齡、性別、身高、體重、體質指數、分娩方式及多胞胎情況等。

1.2.2 WISC-Ⅳ測試 采用WISC-Ⅳ評估研究對象的認知水平，分別統計言語理解指數(verbal comprehension index，VCI)、知覺推理指數(perceptual reasoning index，PRI)、工作記憶指數(working memory index，WMI)和加工速度指數(processing speed index，PSI)4項指標的得分，最終計算獲得總智商(full scale IQ，FSIQ)分值。

1.2.3 血液采集及RNA提取 未采接受任何治療前，由專業醫師抽取研究對象靜脈血液1 mL并加入3 mL紅細胞裂解液室溫裂解10 min，3 000 r/min離心5 min后收集底部白細胞沉淀，之后加入1 mL TRIzol室溫裂解5 min，12 000 r/min離心10 min后，去上清并加入200 μL氯仿，震蕩后將上層水相轉移至新的Ep管中，加入等體積的異丙醇室溫放置20 min，之后離心獲得RNA沉淀，使用75%的乙醇清洗后加入30 μL RNase-free水，檢測RNA濃度和純度。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR) 將血液中獲得的RNA按照試劑盒說明書將合格RNA反轉錄為cDNA。反應體系為20 μL。反應條件：50 ℃反應2 min；95 ℃反應2 min；95 ℃反應15 s；60 ℃反應32 s。每個樣品重復3次。BAIAP2 mRNA的相對表達量計算公式：△Ct=(均值±靶基因Ct-內參比Ct標準差)；△△Ct=(被試樣本目標基因△Ct-參考樣本目標基因△Ct)均值±標準差；相對表達=(2-△△Ct)均值±標準差。引物序列：BAIAP2正向引物5′-AGGAGGTGTTTCTGCTCTGG-3′，反向引物5′-AATAGCAGTCTGGGGTCTGG-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.3 動物實驗方法

1.3.1 實驗動物及處理 有研究表明，4～10周齡的自發性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)表現出與ADHD癥狀相似的行為學和中樞系統變化，是目前模擬ADHD實驗的理想動物模型，廣泛應用于ADHD的癥狀學、機制及治療的基礎研究[10]。本研究選擇無特定病原體(SPF)級雄性SHR 30只，SPF級雄性Wistar大鼠10只，4周齡，體質量180～240 g，每籠5只，購自北京維通利華公司。飼養在SPF級動物實驗室，室溫(25±2)℃，光照循環時間為08：00～20：00，濕度為50%～60%。

將30只SHR隨機分為SHR組、生理鹽水組(Sal組)及鹽酸哌甲酯組(MH組)，各10只。其中SHR組不進行任何處理，Sal組大鼠給予生理鹽水(1.5 mg/kg)灌胃處理2周，MH組大鼠給予鹽酸哌甲酯(安楊森制藥有限公司生產，規格：每片18 mg，批號：7JE540)1.5 mg/kg灌胃處理2周。正常Wistar大鼠納入Con組(10只)不進行任何干預。

1.3.2 行為學測定

1.3.2.1 曠場實驗(open field test，OFT) OFT評定SHR模型自發性活動能力及焦慮樣水平。首先將曠場(100 cm×100 cm)劃分為外周區和中央區(30 cm×30 cm)，觀察時將單只大鼠置于光潔曠場中央，采用視頻攝像系統Smart 3.0軟件記錄大鼠5 min內運動距離及在中心區的時間。

1.3.2.2 Y迷宮實驗(Y maze test，YMT) YMT評定SHR模型認知缺陷。該裝置包括3個閉合臂(50 cm×10 cm，40 cm壁)，與中心平臺之間角度呈120°。將每只大鼠輕輕置于中心平臺中，面對相同的迷宮，并許其自由探索3條手臂，持續6 min。由視頻攝像系統Smart 3.0記錄進入手臂的順序。成功交替的定義：大鼠連續進入第3個手臂，之后進入前2個手臂。自發交替次數(%)=(成功交替次數/單項總數-2)×100%。

1.3.3 透射電鏡實驗 大鼠拉頸處死立即在冰上將前額葉取出，并切割為1 mm3，之后置于電鏡固定液中固定24 h，使用1%鋨緩沖液固定2 h。依次使用丙酮/環氧樹脂(2∶1)、丙酮/環氧樹脂(1∶1)、環氧樹脂溶液中浸泡，使用環氧樹脂包埋組織。將下丘腦樣本切成約50 nm厚薄片，在醋酸二惡烷鈾中浸泡45 min，進行電子染色。使用H-7650透射電鏡采集神經元超微結構圖像。

1.3.4 免疫熒光實驗 行為學檢測結束后將大鼠前額葉分離，甲醛固定并脫水沉糖后采用OCT包埋前額葉并按照冠狀位進行切片(20 μm)以備后續的免疫熒光染色。首先將腦片進行抗原修復，之后采用10%的正常山羊血清室溫封閉處理1h，使用BAIAP2抗體(abcam，ab126057)4 ℃孵育過夜，次日將腦片從冰箱取出后進行室溫復溫30 min，采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次，每次10 min，二抗室溫下孵育2 h，采用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行復染細胞核。顯色后，采用熒光顯微鏡觀察PSD95及SYN蛋白的陽性細胞數量。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料及WISC-Ⅳ評分比較 兩組臨床資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。與對照組比較，ADHD組VCI、PRI、WMI、PSI和FSIQ得分均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表1 兩組臨床資料比較

表2 兩組WISC-Ⅳ評分比較(±s) 單位：分

2.2 兩組BAIAP2 mRNA表達及臨床意義 ADHD組血液BAIAP2 mRNA表達低于對照組(t=-8.550，P<0.05)，詳見圖1。BAIAP2 mRNA表達量與WISC-Ⅳ得分的Pearson相關性分析結果顯示：血液BAIAP2 mRNA表達與VCI、PRI、WMI、PSI及FSIQ評分均呈正相關，詳見圖2。以血液BAIAP2 mRNA濃度為檢驗變量，以ADHD為狀態變量，繪制ROC曲線，結果顯示，BAIAP2mRNA的ROC曲線下面積(AUC)為0.879 4，95%CI[0.810 5，0.914 2]，靈敏度為77.1%，特異度為80.0%，P<0.001，詳見圖3。

兩組比較，＊P<0.05。圖1 兩組BAIAP2 mRNA表達量比較柱狀圖

圖2 BAIAP2 mRNA與WISC-Ⅳ得分的相關性散點圖(A為VCI與BAIAP2 mRNA相關性；B為PRI與BAIAP2 mRNA相關性；C為WMI與BAIAP2 mRNA相關性；D為PSI與BAIAP2 mRNA相關性；E為FSIQ與BAIAP2 mRNA相關性)

圖3 BAIAP2 mRNA的ROC曲線

2.3 動物行為檢測結果 OFT結果顯示，與Con組比較，SHR組大鼠曠場中運動距離增加(P<0.05)，且曠場中央區滯留時間延長(P<0.05)；MH組大鼠運動距離和進入曠場中央區時間較Sal組大鼠減少(P<0.05)。YMT結果顯示，與Con組比較，SHR組大鼠自發交替次數正確率降低(P<0.05)；與Sal組比較，MH組大鼠自發交替次數正確率升高(P<0.05)。詳見圖4。

SHR組與Con組比較，＊P<0.05；MH組與Sal組比較，#P<0.05。圖4 SHR模型大鼠行為學改變(A為曠場的行動軌跡；B為大鼠曠場的運動距離柱狀圖；C為曠場中央區時間柱狀圖；D為自發交替次數正確率柱狀圖)

2.4 SHR模型BAIAP2 mRNA表達情況 與Con組比較，SHR組BAIAP2 mRNA表達降低(P<0.05)；與Sal組比較，MH組BAIAP2 mRNA表達升高(P<0.05)。免疫熒光染色進一步提示，SHR組和Sal組大鼠前額葉BAIAP2 mRNA陽性細胞數量少于Con組和MH組(P<0.05)。詳見圖5。

SHR組與Con組比較，＊P<0.05；MH組與Sal組比較，#P<0.05。

圖5 SHR模型BAIAP2 mRNA表達情況(A為BAIAP2 mRNA相對表達量柱狀圖；B為BAIAP2陽性細胞數柱狀圖；C為前額葉BAIAP2 mRNA陽性細胞免疫熒光檢測圖)

2.5 SHR模型突觸結構改變 與Con組比較，SHR組大鼠突觸超微結構出現變化，主要表現為突觸間隙增寬，突觸后致密物減少及突觸曲面率降低(P<0.05)；與Sal組比較，MH組大鼠突觸間隙減小，突觸后致密物增多及突觸曲面率升高(P<0.05)。采用Pearson相關性分析結果顯示：額葉BAIAP2 mRNA表達與突觸后致密物和突觸曲面率呈正相關，與突觸間隙呈負相關。詳見圖6、圖7。

SHR組與Con組比較，＊P<0.05；MH組與Sal組比較，#P<0.05。圖6 SHR模型突觸結構改變(A為SHR模型突觸結構改變；B為SHR模型突觸結構改變柱狀圖)

圖7 SHR模型突觸結構與BAIAP2 mRNA相關性分析散點圖(A為觸曲面率與BAIAP2 mRNA相關性；B為突觸間隙與BAIAP2 mRNA相關性；C為突觸后致密物與BAIAP2 mRNA相關性)

3 討 論

ADHD是嚴重影響兒童體智發展的常見神經發育障礙性疾病。有研究顯示，罹患ADHD的患兒出現注意力不集中、多動和沖動等癥狀，且伴有不同程度的認知、情感和運動控制障礙，這些癥狀不僅嚴重影響患兒認知功能和智力發展，同時成為誘導青春期和成年期社交障礙和犯罪的重要危險因素[3]。本研究結果顯示，ADHD患兒VCI、PRI、WMI、PSI和FSIQ得分均降低，提示ADHD患兒注意力和執行功能出現嚴重缺陷，與房海波等[11]研究結果一致。由于ADHD病因較多，涉及復雜的遺傳生理學、心理學及環境等綜合因素，目前關于ADHD的機制及臨床標志物的研究尚未明確，需積極研究尋找ADHD的潛在病理機制及生物學標志物，有助于闡明發病機制并協助臨床診斷。

BAIAP2主要富集在大腦皮層中的興奮性神經元中，BAIAP2表達紊亂參與自閉癥、多動癥和精神分裂癥等多種神經系統疾病[12-13]。一項研究顯示，BAIAP2基因多態性是ADHD易感性的重要危險因素[6]。有研究顯示，ADHD受試者BAIAP2基因rs7210438和rs8079626位點變異與注意缺陷的嚴重程度、沖動和憤怒等行為有關，且BAIAP2基因多態性與ADHD大腦影像的默認模式網絡連通性和不對稱性改變有關[5]。然而ADHD患兒血液BAIAP2 mRNA表達水平及臨床意義尚未明確。本研究結果顯示，ADHD患兒血液BAIAP2 mRNA相對表達量與WISC-Ⅳ量表中各子指標得分均呈正相關，表明血液BAIAP2 mRNA相對表達量降低程度與注意缺陷程度和認知障礙程度有關。本研究結果顯示，BAIAP2 mRNA的AUC為0.879 4，靈敏度為77.1%，特異度為80.0%，95%CI[0.810 5，0.914 2]，P<0.001，表明BAIAP2 mRNA診斷ADHD具有較高的臨床價值，因此，臨床醫師可結合患兒血清BAIAP2 mRNA相對表達量和臨床癥狀，協助ADHD臨床診斷。

突觸可塑性是突觸結構與功能受到外界刺激后的適應性改變，突觸結構變化是突觸功能變化的基礎，涉及ADHD認知及記憶等特征改變[14]。有研究顯示，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路通過改變神經發育過程中突觸結構可塑性，導致ADHD，因此，突觸可塑性可能是涉及ADHD發生的潛在機制[15]。腦區中富含樹突棘的區域BAIAP2高度表達，在培養神經元中BAIAP2 表達下調，引起樹突棘密度和大小減低，導致突觸結構改變[16]。因此，本研究通過構建SHR模型，基于動物實驗探討BAIAP2介導的突觸結構改變是否涉及ADHD樣行為的發生和治療。

SHR是模擬ADHD癥狀的動物模型，鹽酸哌甲酯是臨床治療ADHD的一線藥物，基礎實驗研究可改善SHR模型缺陷行為。本研究結果顯示，與Con組比較，SHR組大鼠曠場中的運動距離增加，在曠場中央區滯留延長；給予鹽酸哌甲酯治療后，SHR大鼠運動距離和進入曠場中央區時間減少，表明SHR大鼠表現為沖動和多動行為，治療后這種缺陷行為得到改善。同時本研究結果顯示，與Con組比較，SHR組自發交替次數正確率降低，治療后自發交替次數正確率升高，表明SHR認知功能減輕，鹽酸哌甲酯可逆轉SHR大鼠的認知缺陷。同時本研究結果顯示，與Con組比較，SHR組大鼠前額葉中BAIAP2 mRNA表達水平降低；給予鹽酸哌甲酯治療后，BAIAP2 mRNA升高，提示BAIAP2有缺陷行為和按治療的SHR中存在變化。透射電鏡結果顯示：SHR大鼠突觸后致密物減少，突觸間隙增寬；治療后突觸后致密物增多，突觸間隙減小，且BAIAP2 mRNA表達量與突觸后致密物、突觸間隙存在相關性，表明BAIAP2 mRNA涉及SHR的突觸結構變化。Sawallisch等[17]研究顯示，BAIAP2敲除通過降低突觸后密度，導致海馬長時程增強和嚴重學習缺陷。生物信息學研究表明，BAIAP2參與突觸后致密物的形成，其缺陷導致突觸結構功能障礙，并誘導注意功能缺陷[18]。提示BAIAP2介導的突觸結構可塑性是參與SHR行為學癥狀改變的重要病理機制。

綜上所述，臨床隊列發現ADHD患兒血液BAIAP2 mRNA相對表達量降低，BAIAP2 mRNA相對表達量與WISC-Ⅳ量表得分呈正相關，且BAIAP2 mRNA對診斷ADHD發生具有較高的靈敏度和特異度，有助于臨床醫師診斷ADHD發生。同時SHR發現BAIAP2介導的突觸結構可塑性是參與SHR行為學癥狀改變的重要機制，有助于從突觸結構方面解釋BAIAP2生物學意義和ADHD的發病機制。