基于“雅解理論”探討雅解益栽（心）方藥物血清對CSE誘導VEC-304細胞損傷的影響

駱始華 李易 趙麗娟 陶希睿 劉中勇 段小花 田慧 張超

基金項目：

云南省科技廳基礎(chǔ)研究專項-面上項目（202101AT070250）；中國民族醫(yī)藥學會科研項目（2021Z1331-361001）；云南省科技廳中醫(yī)聯(lián)合專項-面上項目（202101AZ070001-231）；云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院“卓越青年人才計劃（復合型）”項目（編號：云中附黨字［2022］3號）；云南省科技廳中醫(yī)聯(lián)合項目-青年項目（202001AZ070001-094）；云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室開放課題項目（2021K002）;云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室開放課題項目（202210ZD2211）。

作者簡介：

駱始華（1984—），男，彝族，博士，副主任醫(yī)師，研究方向為民族醫(yī)藥及心血管疾病臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail：luotuozlj@163.com

通信作者：

張超（1959—），男，漢族，研究生，教授，研究方向為民族醫(yī)藥臨床及實驗研究。E-mail：1055705389@qq.com

【摘? 要】

目的：觀察香煙提取物（CSE）誘導血管內(nèi)皮（VEC）-304的存活率、細胞增殖抑制率的變化，測定細胞裂解液的抗氧化能力，檢測細胞相關(guān)凋亡蛋白的表達，探討雅解益栽（心）方藥物血清對CSE誘導的VEC-304細胞損傷的影響。方法：采用CSE復制VEC-304細胞損傷模型，雅解益栽（心）方含藥血清倍比稀釋后分為3個劑量干預組（體積分數(shù)10%），采用MTT、TUNEL、DNA ladder、免疫組化以及Western Blot等方法，檢測雅解益栽（心）方藥物血清對CSE誘導的（VEC）-304細胞損傷的影響。結(jié)果：CSE可誘導細胞凋亡，其機制與其引發(fā)細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)；誘發(fā)細胞Caspase-3、Bax、NF-κb表達上調(diào)，Bcl-2、p53下調(diào)，而致細胞凋亡。雅解益栽（心）方干預組細胞SOD、GSH-px、GSH含量比空白對照組高，MDA及NOS比空白對照組低；而Caspase-3、Bax、NF-κb表達下調(diào)，Bcl-2、p53表達上調(diào)。并有一定的量效依賴關(guān)系。結(jié)論：CSE能誘導VEC-304細胞凋亡，雅解益栽（心）方藥物血清有明顯的抗氧化作用，能抑制細胞凋亡，從而具有解煙毒作用。

【關(guān)鍵詞】

香煙提取物（CSE）；VEC-304細胞；細胞凋亡；雅解益栽（心）方；抗氧化

【中圖分類號】??? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）24-0014-08

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.24.zgmzmjyyzz202324004

Effect of Yajie Yizai （Xin） Prescription Drug Serum on CSE Induced VEC-304 Cell njury Based on the “Yajie Theory”

LUO Shihua1? LI Yi2? ZHAO Lijuan2? TAO Xirui3? LIU Zhongyong4? DUAN Xiaohua1? TIAN Hui1? ZHANG Chao1*

1. Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500，China；

2.The Affiliated Hospital of Yunnan university of Chinese Medicine， Kunming 650021，China；

3. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy Magazine， Kunming 650021，China;

4.The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China

Abstract：

Objective To observe the changes of survival rate and cell proliferation inhibition rate of vascular endothelial （VEC）-304 induced by cigarette extract （CSE）， determine the antioxidant capacity of cell lysate， detect the expression of apoptosis protein， and explore the effect of Yajie Yizai （Xin） drug serum on CSE-induced VEC-304 cell injury.Method Vec-304 cell damage model was replicated by CSE， and Yajie Yizai （Xin） drug-containing serum was diluted at multiple ratio and divided into 3 dose intervention groups （10% by volume fraction）. MTT， TUNEL， DNAladder， immunohistochemistry and WesternBlot were used.The effect of Yajie Yizai （Xin） drug serum on CSE-induced （VEC）-304 cell damage was detected.Results CSE can induce cell apoptosis， and its mechanism is related to the oxidative stress response of cells.The expression of caspase-3， Bax， NF-κ B was up-regulated， and the expression of Bcl-2， p53 was down-regulated， resulting in apoptosis.2. The contents of SOD， GSH-Px and GSH in Yajie Yizai （Xin） intervention group were higher than those in blank control group， while MDA and NOS were lower than those in blank control group.The expressions of Caspase-3， Bax and NF-κ B were down-regulated， while the expressions of Bcl-2 and p53 were up-regulated.And there is a certain dose-effect dependence.Conclusion CSE can induce apoptosis in VEC-304 cells， and Yajie Yizai （Xin） drug serum has a significant antioxidant effect， which can inhibit cell apoptosis and thus have a detoxifying effect.

Keywords：

Cigarette extract （CSE）；VEC-304cell；Apoptosis； Yajie Yizai （Xin）； Prescription

傣醫(yī)理論認為動脈粥樣硬化是人們過量飲食導致的“食物毒”。傣醫(yī)“雅解”理論最具特色，其核心內(nèi)容包括“未病先解，先解后治，同解同治”及系列“雅解”方藥，而解“食物毒”是“雅解”理論的重要組成部分。雅解學說中的“毒”不僅是一個具有物質(zhì)屬性的概念，同時也是一個具有病理學屬性的概念［1］。其內(nèi)涵具有廣義與狹義之分。狹義的毒，乃為一類特殊的致病因素，如煙毒、食毒、蟲毒等。廣義的毒則具有病因和病機雙重屬性，其實質(zhì)強調(diào)在病因作用下，疾病發(fā)生和發(fā)展驟然變化，出現(xiàn)功能破壞和形質(zhì)受損。筆者認為傣醫(yī)的“雅解”理論體現(xiàn)了傣醫(yī)超前而樸素的醫(yī)學思想，“雅解”（解藥）方藥有著千百年臨床應(yīng)用的歷史經(jīng)驗的積淀，其臨床功效雖然是多方面的，但主要集中體現(xiàn)在對有害物質(zhì)或毒素（包括有毒物質(zhì)、過剩的營養(yǎng)物質(zhì)、酒精、藥物等）的排泄或解除上［2］。傣醫(yī)“雅解”方藥所解之“毒”其內(nèi)涵非常豐富，除包括了毒性物質(zhì)、機體代謝產(chǎn)物、過剩的營養(yǎng)物質(zhì)，以及食物中的有害物質(zhì)、酒精、煙草、藥物等毒性或毒副作用外，也包含了有害物質(zhì)（毒素）所引起的疾病或臨床癥候群。因此其“解毒”作用當然也包含有非特異“解毒”作用，以及特定的“酒毒”“煙毒”“食物毒”的“解毒”作用的兩個方面［3］。吸煙是導致冠心病的危險因素之一，這是因為煙草燃燒時釋放的煙霧中含有多種已知的化學物質(zhì)，其中包括一氧化碳、尼古丁等，這些化學物質(zhì)有多種生物學作用，對人體造成多種危害［4］。血管內(nèi)皮細胞通常指襯于心、血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平上皮，它形成血管的內(nèi)壁，它們具有吞噬異物、細菌、壞死和衰老的組織，還參與集體免疫活動功能。近年有研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧提取物（cigarette smoke extrat，CSE）中含有豐富的氧化劑和自由基，可導致細胞凋亡。有研究表明，傣醫(yī)雅解益栽（心）方（以下簡稱YJYXF）除具有降脂作用外，還有抗氧化作用。故本研究采用體外細胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)血管內(nèi)皮（VEC）-304細胞，雅解益栽（心）方（YJYXF）藥物干預CSE誘導的VEC-304細胞，檢測其抗氧化能力，探討YJYXF藥物血清對CSE誘導的VEC-304細胞損傷的影響，闡述其解煙毒可能機制，并篩選其最佳抗氧化劑量。

1? 材料與儀器

1.1? 材料? 香煙提取物（CSE）：參照香煙煙霧標準采氣速率法，用50 mL注射器抽吸，每2 s抽氣30 mL，間隔58 s抽氣1次。連續(xù)抽取5支香煙，使香煙提取物的濃度為1支/mL。以5 mLDMEM為吸收液在使用前30min制備。最后用0.22 μL孔徑的濾膜過濾形成CSE原液，將懸液調(diào)至pH 7.4備用，將收集的混合液定義為100% CSE。YJYXF飲片由云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供，取水煎液，終濃度為2 g生藥/mL；VEC-304細胞購自中山大學實驗動物中心。

1.2? 主要試劑? 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）、胰蛋白酶、Quick-g DNAminiprep試劑盒（ZYMO公司）、MTT試劑盒（杭州碧云天生物科技有限公司）、TUNEL檢測試劑盒（美國sigma公司）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒、一氧化氮合酶（NOS）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司）、NF-Kb p65 antibody、BAX antibody、Caspase-3 antibody、P53 antibody（Santa cruz）。

1.3? 儀器及設(shè)備? 生物顯微鏡（olympus）;熒光定量PCR儀（美國Invitrogen公司）;PCR儀（美國thermo公司）;TY-80B脫色搖床（江蘇金壇市萊華儀器制造有限公司）;酶標儀（美國biotek公司）;DYY7C型電泳儀電源（北京市六一儀器廠）;電泳槽、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀（Tanon公司）。

2? 方法

2.1? 含藥血清的制備? 以人臨床等效劑量5倍劑量給大鼠灌胃，每天2次，連續(xù)7 d，正常對照組給予等量生理鹽水。于末次給藥后1 h（灌藥前禁食不禁水12 h）頸動脈取血，分離血清，56℃滅活30 min，0～22的微孔濾膜過濾除菌，密封后置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2? 細胞分組及處理? 細胞株培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清、1%PS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、CO2體積分數(shù)5%的飽和濕度環(huán)境。細胞呈單層貼壁生長。待細胞生長達90％左右時傳代，約2 d消化傳代1次（0.25%胰酶含EDTA0.02%），細胞計數(shù)板計數(shù)，重復3次，取對數(shù)生長期細胞為實驗對象，細胞分裝傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞單層長滿時開始干預。

2.3? 細胞分組及干預方法? 取對數(shù)生長期細胞進行實驗，調(diào)整細胞密度為1×105 /L。按照1∶[KG-*3/5]1比例用空白血清將含藥血清稀釋為高、中、低3個濃度，然后將含藥血清和條件培養(yǎng)基混合，控制比例為含藥血清10%。實驗共分為5組：正常對照組（條件培基），空白血清對照組（條件培基中給予5%CSE刺激+空白血清10%），含藥血清高、中、低劑量組（條件培基中給予5%CSE刺激+含藥血清10%），含藥血清中劑量組，含藥血清低劑量組。

2.4? DNA ladder? 收集各組細胞上清液及細胞，刮下貼壁細胞，重懸，室溫靜置5～10min；移裂解液至放在收集管上的ZYMO-spin column中，10000 g，1min，棄收集管（含F(xiàn)t）；ZYMO-spin column 移至新的收集管上，加200 μLDNA Pre-Wash Buffer，10000 g，1min；加500 μLg-DNA Wash Buffer，10000 g，1min；ZYMO-spin column 移至新的1.5 mLEP管上，加50 μLDNA Elution Buffer或水，室溫孵育2～5min，13000 g，30 s，做好標記，測濃度并保存至-20℃。

2.5? 電泳? 配制1%瓊脂糖凝膠，置入1×TAE緩沖液的電泳槽中；上樣：取DNA樣品10 μL上樣，電壓80 V電泳，根據(jù)指示劑的遷移情況終止電泳。染色劑染色后在紫外分析儀下觀察，拍照。

2.6? MTT法檢測細胞抑制率? 取對數(shù)期生長的VEC-304細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，每孔細胞懸液200 μL接種于96孔細胞板，在37℃下，二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，PBS沖洗2次，每孔加入20 μLMTT溶液，在37℃下，二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，棄去MTT液，每孔再加入200 μLDMSO，室溫下振蕩1min，至MTT完全溶解，于酶標儀上490 nm波長處讀取各孔光吸收OD值，求出平均值。以公式計算細胞存活率（細胞存活率=處理組OD值/正常對照組OD值×100%）。

2.7? TUNEL法檢測細胞凋亡? 收集VEC-304細胞，脫蠟、水化、浸洗、固定、處理組用1 μLrTdT＋1 μL 生物素標記的dUTP＋98 μL平衡液混勻；而陰性對照組不加rTdT，改為三蒸水；陽性對照組先加入100 μL DNase 1 緩沖液孵育5min，甩掉液體后再加100 μL DNase 1（10 U/mL）酶切10min，用去離子水沖洗4次，PBS浸洗5min，加100 μLTUNEL反應(yīng)混合液于標本上，加100 μLstreptavidin標記HRP（按1∶[KG-*3/5]500 PBS稀釋）30min；DAB顯色（避光）、用蘇木素復染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，并記錄細胞凋亡情況。

2.8? 氧化物及抗氧化系統(tǒng)的檢測? 將收集各組細胞用洗兩次后，采用細胞超聲裂解儀制成細胞裂解液，采用試劑盒檢測超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮合酶（NOS）及丙二醛（MDA）含量。

2.9? 免疫組化分析? 將已消毒的20 mm蓋玻片置于90 mm培養(yǎng)皿中，按2×104/mL的細胞密度將細胞接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，5 d后進行免疫細胞組織化學染色鑒定。PBS溶液沖洗3min×3次。甲醛固定15min；空氣干燥5min。PBS清洗標本3次各2min，DPBS配孵育1次20min。PBS清洗標本3次各2min。3%H2O2孵育15min。PBS清洗標本3次各2min，封閉血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。一抗孵育（PBS配，滴度1∶[KG-*3/5]200，濕盒）4℃過夜。抗體情況見表1。

PBS清洗標本3次各5min。二抗工作液孵育pv6001（濕盒）37℃30min。PBS清洗標本5次各2min。DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）約10～15min。蒸餾水或自來水洗1次5min。（可放六孔板內(nèi)，再將孔板放在飯盒等內(nèi)，自來水下沖洗），蘇木素復染10min。自來水洗5min。樹膠封片。生物顯微鏡閱片。

2.10? Western Blot分析法檢測細胞相關(guān)蛋白表達情況? 加入 ＲIPA 裂解液提取總蛋白，15min 后使用 BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度。取蛋白 40 μg 進行 SDS—PAGE 電泳分離蛋白，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜并使 用脫脂奶粉封閉 1 h; 加入 NF-Kb p65、SC-372、Santa Cruz Biotechnology、1∶[KG-*3/5]50，BAX、5023S、celling Signaling technology、1∶[KG-*3/5]100，Caspase-3、SC-7148、Santa Cruz Biotechnology、1∶[KG-*3/5]50，p53、SC-47698、Santa Cruz Biotechnology、1∶[KG-*3/5]50 一抗試劑，4℃過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗試 劑 （1∶[KG-*3/5]6000） 在室溫下孵育 50min，PBST 清洗后200～300 μLECL 曝光，用TBST洗膜5遍，每次5min，準備曝光。并進行曝光和顯影及灰度值分析。

3? 結(jié)果

3.1? YJYXF對VEC-304細胞凋亡的影響? DNA ladder電泳圖檢測結(jié)果顯示，正常組基因組DNA聚集在一條帶上，說明沒有發(fā)現(xiàn)DNA凋亡降解，空白對照組和低劑量組DNA電泳成彌散狀，在中劑量和高劑量組，彌散狀基本消失，說明干預對DNA的凋亡降解有保護作用。如圖1所示。

MTT檢測結(jié)果顯示，各組細胞的存活率以空白對照組最低。24 h后與空白對照組比較，正常對照組及高、中劑量組均有明顯差異，且隨時間延長差異更明顯（P<0.05）；空白對照組凋亡率明顯高于正常對照組及高、中、低劑量組。提示YJYXF可明顯提高CSE誘導內(nèi)皮細胞存活率，抑制細胞凋亡。見表2，如圖2所示。

TUNEL法結(jié)果檢測結(jié)果顯示（如圖3所示）， 空白對照組中圖片可見細胞發(fā)生典型的凋亡，在正常細胞組見散在的凋亡細胞，干預組與空白對照組比較，高劑量凋亡細胞少見。

空白對照組凋亡率明顯高于對照組及高低劑量組，二者差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果如圖4所示。兩實驗組細胞凋亡率均低于空白對照組（P<0.05）。提示YJYXF可抑制細胞凋亡。見表1，如圖1、圖2所示。

3.2? YJYXF對各組細胞SOD、GSH-Px、GSH、NOS、MDA的影響? 結(jié)果見表3，如圖5所示，空白對照組SOD、GSH-px、GSH含量均比正常對照組低，而MDA及NOS均比正常對照組高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；高、中、低劑量組 SOD、GSH-px、GSH含量比空白對照組高，MDA及NOS比空白對照組低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），尤其以高劑量組更明顯（P<0.01），提示YJYXF藥物血清有明顯的抗氧化能力，且有一定的量效關(guān)系。

2.3? YJYXF對CSE誘導內(nèi)皮細胞凋亡蛋白影響? 結(jié)果如圖6和圖3 Western Blot分析。與空白對照組比較，Caspase-3、 NF-κb（p65）、Bax的陽性條帶與GAPDH比值降低（P<0.05）。p53的陽性條帶與GAPDH比值升高（P<0.05）。表明YJYXF能夠抑制Caspase-3、NF-κb、Bax，促進p53表達來保護內(nèi)皮細胞。提示YJYXF對CSE誘導的ECV304細胞相關(guān)凋亡基因的異常表達有調(diào)控作用。

4? 討論

傣醫(yī)學是傣族人民在兩千多年的生活和醫(yī)療實踐中形成的以“四塔”“五蘊”為基礎(chǔ)理論的核心，“三盤”學說、“雅解”學說為理論特色的一門醫(yī)學學科；其中，傣醫(yī)“雅解”理論最具特色，其核心內(nèi)容包括“未病先解、先解后治，同解同治”及系列“雅解”方藥，而解“食物毒”是“雅解”理論的重要組成部分。“雅解”為傣語，意譯為解藥，指能解除體內(nèi)各種毒素，平衡和協(xié)調(diào)“四塔五蘊”以及臟腑功能的一類傣醫(yī)方藥的統(tǒng)稱。雅解理論和雅解（解藥）方藥在疾病的防治中起了重要的作用。傣醫(yī)認為人體要保持健康必須常服用雅解（解藥）以排出人體內(nèi)小毒并以此創(chuàng)立了解藥，在傣族民間家家都備有不同的解藥，有解食物毒、酒毒、煙毒、毒蟲毒、熱毒、火毒等，傣醫(yī)的雅解理論和雅解（解藥）方藥的臨床適應(yīng)癥較為廣泛，特別是對心血管疾病、代謝性疾病、消化系統(tǒng)疾病等均有肯定的療效。

傣醫(yī)認為當人體發(fā)病后應(yīng)先服用“解藥”，用來由于過食而產(chǎn)生“食物毒”，通過服用“解藥”以解除煙毒產(chǎn)生的毒副作用，以解除人體的毒素，從而調(diào)節(jié)人體生理功能，保持體內(nèi)“四塔”（風、火、水、土）、“五蘊”（色、識、受、想、行）功能的平衡和協(xié)調(diào)［1］。“雅解益栽（心）方”是從傣醫(yī)臨床文獻資料中收集整理的民族有效驗方，該方具有調(diào)節(jié)體內(nèi)“四塔、五蘊”功能［4］，可解除人體毒素，保護臟腑功能。“雅解益栽（心）方”的藥物組成中［5］，雅解先打（傣百解）、文尚海（百樣解）性涼，入風、火、水、土塔，調(diào)四塔，解酒毒、熱毒和其他毒，護臟腑為主藥；嘿濤罕（大黃藤）性寒涼，入四塔，有調(diào)四塔，解百毒之作用。蟑螂味咸，入土、水塔，解毒健脾之功；咪多領(lǐng)性溫，補火塔，理氣止痛；毫命（姜黃）味苦、微辣，有臭氣，性平偏熱，入水、土、風塔。具活血止痛、清火解毒之功。管底（三葉蔓荊）根味苦、性涼，入風、水、土塔，清火解毒，治瘡癤腫痛等組成。全方合用具有調(diào)補四塔、清火解毒之作用，可達調(diào)補氣血，解熱毒、酒毒、食物中毒及保護心肝腎之目的。全方合用具有調(diào)補四塔、清火解毒之作用，可達調(diào)補氣血，解熱毒、酒毒、食物毒及保護心肝腎之目的。

4.1? 香煙與動脈粥樣硬化? 香煙中的CO使血液中的氧氣含量減少是造成心血管疾病的主要原因。吸煙可致冠狀動脈血管收縮，導致血液供應(yīng)不足、心肌缺血。長期的刺激可造成血管內(nèi)皮改變［5］。進而影響血液循環(huán)，導致心腦血管及呼吸系統(tǒng)等多種疾病。吸煙過程中還易產(chǎn)生自由基，損傷血管內(nèi)皮致多種慢炎癥性疾病。CO經(jīng)呼吸可穿透肺泡進入肺組織間隙，隨著循環(huán)系統(tǒng)擴散至微血管作用于血管內(nèi)皮。受損的內(nèi)皮細胞在氧化應(yīng)激和炎癥刺激下可吸附單核細胞，吞噬脂質(zhì)成為成泡沫細胞，形成脂質(zhì)斑塊，使動脈管腔狹窄，管壁失去彈性形成動脈粥樣硬化［6］。

4.2? 氧化應(yīng)激損傷與動脈粥樣硬化? 氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡是維持內(nèi)皮細胞功能的關(guān)鍵因素［7-11］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是細胞內(nèi)的抗氧化酶，可通過清除超氧陰離子減輕活性氧（reactive oxygen species，ROS）損害從而保護內(nèi)皮細胞，SOD活性的高低可反映機體抗氧化損傷能力。脂質(zhì)在自由基作用下可發(fā)生過氧化反應(yīng)，其不飽和脂肪酸氧化終產(chǎn)物為丙二醛（malonaldehyde，MDA），可引起核酸及蛋白質(zhì)等生命大分子交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細胞毒性，MDA含量的高低可反映內(nèi)皮細胞氧化損傷的嚴重程度。乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase， LDH）存在于內(nèi)皮細胞，當細胞受損時細胞膜結(jié)構(gòu)和細胞質(zhì)內(nèi)氧依賴性酶受到影響，細胞膜通透性增加，細胞外液LDH漏出量相應(yīng)增加，因此LDH含量的高低可反映內(nèi)皮細胞損傷程度［7-13］。

NOX （nadph oxidase）首先發(fā)現(xiàn)于中性粒細胞和巨噬細胞，在炎癥反應(yīng)時這兩種細胞發(fā)生“氧化爆發(fā)”產(chǎn)生大量ROS而構(gòu)成機體抵抗病原體的第一防線。ROS不再是有氧代謝的副產(chǎn)物，而是具有信號轉(zhuǎn)導、免疫功能、激素生物合成功能的活性產(chǎn)物。NOX和DUOX（dual oxidase）是公認的能夠調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生的特殊功能酶，與吞噬細胞中NADPH氧化酶所制造的ROS不同，NOX和DUOX所產(chǎn)生的ROS不主要起細胞防御功能，而是作為第二信使，參與細胞分化、增殖、凋亡的調(diào)節(jié)［3］。研究［4］表明氧化的低密度脂蛋白能夠激活人冠狀動脈內(nèi)皮細胞中的NOX4而促進ROS的生成。活化的NADPH氧化酶生成過多的ROS又能夠氧化低密度脂蛋白，而氧化的低密度脂蛋白又能促進NADPH氧化酶的活化，進而形成惡性循環(huán)，促進動脈粥樣硬化的形成［14-15］。

本研究結(jié)果表明，運用YJYXF與CSE干預內(nèi)皮細胞后MDA含量、NOS活性及細胞凋亡率明顯降低，SOD及GSH-px活性、GSH含量及細胞存活率明顯升高，表現(xiàn)出了很好的抗氧化應(yīng)激作用。提示YJYXF對血管內(nèi)皮細胞保護的作用機理可能是與其能提高抗氧化能力有關(guān)［16］。

NF-κB（nuclear factor kappa B）蛋白是進化上高度保守的一種免疫反應(yīng)介質(zhì)，不同的細胞外刺激信號都可激活該轉(zhuǎn)錄因子，從而參與細胞的生長、分化、發(fā)育、凋亡、粘附及炎癥反應(yīng)。炎癥因子水平上調(diào)一直被認為是促進動脈粥樣硬化性損傷的原因，許多炎癥因子，諸如IL-6，C-反應(yīng)蛋白CRP都與動脈粥樣硬化及其他心血管病有關(guān)。而NF-kB又是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因子［5-6］。抑制NF-κB通路活化則有助于緩解動脈粥樣硬化［17］。

Bcl-2家族蛋白對細胞凋亡的調(diào)控起了重要作用，其成員包括促凋亡蛋白Bax及抑凋亡蛋白Bcl-2等亞家族，Bax/Bcl-2比值的高低對細胞凋亡起了直接的調(diào)控作用［2］。

DNA ladder及MTT檢測結(jié)果顯示，YJYXF干預對DNA的凋亡降解有保護作用。研究表明，空白對照組Caspase-3、NF-κb（p65）、Bax明顯上調(diào)，Bcl-2、p53明顯下調(diào)，而應(yīng)用YJYXF干預后，Caspase-3、NF-κb（p65）、Bax表達明顯下調(diào)，Bcl-2、p53明顯上調(diào)，從而抑制細胞的凋亡，對內(nèi)皮細胞有保護作用，且具有解煙毒作用。

5? 結(jié)論

YJYXF對CSE作為氧化應(yīng)激源誘導的內(nèi)皮細胞損傷及凋亡具有保護作用，其機制可能與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞相關(guān)凋亡基因的異常表達有關(guān)。從而達到抗氧化功能、保護內(nèi)皮的作用，且二者有一定的量效關(guān)系，該研究闡述雅解學說中“毒”的狹義的煙毒，YJYXF解煙毒可能機制是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞相關(guān)凋亡基因的異常表達，從而達到抗氧化、保護內(nèi)皮的作用，為傣醫(yī)學YJYXF解煙毒是通過保護血管內(nèi)皮，從而具有抗動脈粥樣硬化的作用提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2023-04-01? 編輯：劉? 斌）