UPLC-QqQ/MS法檢測阿膠強骨口服液阿膠及雜皮源成分

陳偉 范文璽 王曉敏 馬芹

基金項目：

十四五重大科技專項“阿膠強骨口服液”等特色大品種培育及中藥民族藥新藥創(chuàng)制研究（2022A03107-2）;第二師鐵門關(guān)市中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才（2020RCTD03）。

作者簡介：

陳偉（1986—），男，漢族，碩士，高級工程師，研究方向為藥物藥理。E-mail：285239579@qq.com

通信作者：

馬芹（1974—），女，漢族，碩士，正高級工程師，研究方向為中藥民族藥。E-mail： 468020596@qq.com

【摘? 要】

目的：建立阿膠強骨口服液中阿膠及摻雜皮源成分的專屬性檢測方法。方法：用序列分析用胰蛋白酶對阿膠強骨口服液及摻入不同雜皮膠的偽品中膠類成分進行酶解，采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-QqQ/MS），選擇阿膠特征分子離子峰m/z 539.8→612.4及牛皮源特征肽A特征離子對m/z 641.3→726.2作為檢測離子對，離子化模式為ESI＋，進行多反應(yīng)監(jiān)測。同時，建立阿膠強骨口服液中馬皮膠成分紅外譜檢測法，結(jié)合質(zhì)譜法鑒別摻偽馬皮膠樣品。結(jié)果：3批購買的阿膠強骨口服液保留時間均與阿膠對照藥材一致，在7.7 min出峰，未出現(xiàn)與牛皮膠溶液對應(yīng)的牛皮特征色譜峰。6批摻入不同雜皮膠（牛皮膠、豬皮膠和馬皮膠）中2批馬皮膠自制口服液檢測出阿膠對照特征峰；2批牛皮膠口服液樣品檢測出牛皮源特征峰。紅外光譜結(jié)果顯示馬皮膠自制口服液在1400～1700 cm-1處吸收峰較特異，可與其它膠質(zhì)進行區(qū)別，補充阿膠強骨口服液對馬皮源成分的鑒別。結(jié)論：該檢測方法專屬性強，可用于阿膠強骨口服液中阿膠及雜皮源成分的檢測，為阿膠強骨口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了新的思路和方法。

【關(guān)鍵詞】

阿膠強骨口服液；超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜；紅外光譜；阿膠

【中圖分類號】R284.1??? 【文獻標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）24-0028-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.24.zgmzmjyyzz202324006

UPLC-QqQ-MS/MS Analysis of Donkey-hide Gelatin and Different Animal Skin Gelatin in Ejiao Qianggu Oral Liquid

CHEN Wei1? FAN Wenxi1? WANG Xiaomin1? MA Qin1*

1. Xinjiang Hua Shidan Pharmaceutical Reaearch CO. LT，Urumqi? 830011， China；

2. Key Laboratory of Bone Health Traditional Chinese Medicine Research and

Development in Xinjiang Production and Construction Corps，Urumqi 830011， China

Abstract：

Objective To establish an exclusive analytical method to identify donkey-hide gelatin and other source gelatin in Ejiao Qianggu Oral Liquid. Methods Identification of donkey-hide gelatin and others source gelatin in Ejiao Qianggu Oral Liquid was performed by the Multiple Reaction Monitoring of rapid resolution liquid chromatography （UPLC） coupled to triple quadruple mass spectrometry （QqQ）， and quantitative ion pair of 539.8 → 612.4 （m/z， Da）， 641.3 →762.2 （m/z， Da） were respective used for the detection of the cow skin origin and Ejiao control ingredients. Further， the horse hide glue and donkey-hide gelatin was distinguished by FT- IR. Results Characteristic molecular peaks of donkey-hide gelatin were detected in the three batches of commercially available Ejiao Qianggu Oral Liquid samples， of which three batches of cowhide source were not detected. Meanwhile， two batches of characteristic peaks of horse-hide gelatin were detected in six batches of homemade oral liquid samples and two batch contained elements of cowhide source， either component of donkey-hide gelatin was not detected in the six batches. It must be added， the IR absorption peaks in 400～1700 cm-1 of horse hide glue was more specific than others gelatin， that compensate for the identification of horse-hide gelatin. Conclusion? Methodological verification shows that the established method is specific， and suitable for the identification of donkey-hide gelatin and others source in Ejiao Qianggu Oral Liquid. This research has provided theoretical support for the optimizing of Ejiao identification methods， and quality evaluation.

Keywords：

Ejiao Qianggu Oral Liquid；UPLC-QqQ-MS/MS；IR；Donkey-hide Gelatin

阿膠強骨口服液是治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的復(fù)方制劑，由熟地黃、黃芪、黨參、枸杞、阿膠、牡蠣等6味藥材組成，是國家3類新藥。目前本品種標(biāo)準(zhǔn)收載于新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第76冊，尚未包含原料阿膠的含量檢測方法［1］。隨著阿膠價格逐年走高，原料阿膠摻偽造假的情況也不斷增多，多以牛皮膠、豬皮膠和馬皮膠等偽造阿膠產(chǎn)品進行售賣，雜皮膠入藥將嚴重影響藥物治療效果，延誤患者的治療效果，降低民眾對中藥信賴。為了保證藥品的質(zhì)量及提高檢測的專屬性，國家藥品監(jiān)管部門連續(xù)頒布了一系列膠類原料和制劑的檢測方法［2-3］，補充了牛皮特征肽A作為檢測牛皮膠摻假的指標(biāo)，但是對馬皮膠和豬皮膠的檢測尚未給出指導(dǎo)方法。為保證阿膠強骨口服液藥品質(zhì)量，本研究參照相關(guān)文獻采用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜（UPLC-QqQ/MS）聯(lián)合紅外光譜同時對藥物進行牛皮源成分特征肽A和阿膠特征多肽［4-5］檢測，檢測效率更高，專屬性的和適用性較強。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀- TQ-D三重四級桿質(zhì)譜系統(tǒng)（沃特世科技（上海）有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（美國PerkinElmer公司）；電子分析天平（CPA225D，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（UV-2600，島津儀器有限公司）；臺式高速離心機（TGL-16M，上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；Waters ACQUITY UPLCBEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）。

1.2? 材料? 阿膠強骨口服液（批號19010801、19100601、19011001，新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司）；豬皮膠強骨口服液自制品（實驗室自制190212和190214）；牛皮膠強骨口服液自制品（實驗室自制190227和190228）；馬皮膠（實驗室自制 190302和190304）；序列分析用胰蛋白酶（美國Promega）；阿膠對照品（批號：121274-201703，中國食品藥品檢定研究院）；牛皮特征肽A（批號：111941-201804，中國食品藥品檢定研究院）；Milli-Q純水；碳酸氫銨（分析純，上海國藥集團）。

2? 實驗方法與結(jié)果

2.1? 超高效液相質(zhì)譜

2.1.1? 樣品的前處理? 取樣品溶液2mL，加1%碳酸氫銨溶液50mL，超聲處理30 min，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，置微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10μL（取序列分析用胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成每1mL中含1mg溶液，臨用時配制），搖勻，37℃ 恒溫酶解12 h，作為供試品溶液。

2.1.2? 對照溶液的制備? 取牛皮特征肽A對照品粉末5.4mg，阿膠對照藥材 0.1095g，分別加1%碳酸氫銨溶液50mL，超聲理（功率180 W，頻率50 kHz）處理30 min，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，置微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，作為對照藥材溶液。

2.1.3? 陰性樣品溶液制備? 取處方中缺膠類藥材的其他藥味，制成陰性樣品溶液。取陰性樣品2mL，照“2.1.1”項下的方法制成陰性樣品溶液。

2.1.4? 液相色譜條件? 采用Waters ACQUITY UPLCBEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）色譜柱，以0.1%甲酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，按下表進行梯度洗脫，流速為0.3mL/min。柱溫為40℃，進樣量為10μL。

2.1.5? 質(zhì)譜條件? 離子化模式ESi+，進行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z 539.8→612.4作為阿膠特征分子峰檢測離子對m/z 641.3→726.2為牛皮源成分的特征離子對。毛細管電壓為3.00 KV，錐孔電壓為30 V，離子源溫度為120℃，除溶劑溫度為450℃，除溶劑氣體為500L/hr，錐孔氣體為50L/hr。碰撞能量為20 V，碰撞氣流速為0.18mL/min［6-7］。

2.1.6? 專屬性試驗? 以陰性樣品、阿膠對照藥材、三批阿膠強骨口服液市售樣品為陽性樣品，選擇阿膠特征分子離子峰m/z 539.8→612.4作為檢測離子對進行測定。結(jié)果顯示陰性樣品中其它五個藥味且都含有微量的阿膠特征氨基酸多肽成分，但因樣品中相應(yīng)離子流峰面積低于阿膠對照藥材溶液相應(yīng)峰面積，均視為未檢出，方法專屬性強。如圖1所示。

2.1.6? 精密度試驗? 取阿膠對照藥材供試溶液，經(jīng)樣品前處理后，連續(xù)進樣6針，進樣量10μL，以阿膠特征分子離子峰m/z 539.8→612.4作為檢測離子對進行測定，結(jié)果離子對峰面積RSD為0.83%精密度良好。

2.1.7? 穩(wěn)定性試驗? 取同一批次阿膠強骨口服液供試品（19100601）溶液，于制備后的0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h進行前處理，按照液相質(zhì)譜方法進行檢測，以阿膠特征分子離子峰進行測定，峰面積RSD為1.77%，RSD均小于5%，表明供試品溶液在制備后的24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8? 重復(fù)性試驗? 按“樣品前處理方法制備阿膠強骨口服液供試品溶液6份，以阿膠特征分子離子對作為檢測離子對進行測定，進樣量10 μL，結(jié)果6份溶液峰面積RSD為2.44%，重復(fù)性良好。

2.1.9? 樣品檢測? 以所建立的方法對3批阿膠強骨口服液（19010801、19100601、19011001）進行檢測，均檢出阿膠特征分子離子峰（圖1）。

2.1.10? 牛皮源成分檢測? 對3批購買的阿膠強骨口服液檢測結(jié)果表明阿膠特征峰保留時間均與阿膠對照藥材一致，在7.7～7.8 min出峰，未出現(xiàn)與牛皮膠特征肽A對照對應(yīng)的牛皮特征色譜峰（圖2）。6批摻假口服液中2批牛皮膠口服液和2批牛皮膠樣品均檢測出了牛皮源特征峰，未出現(xiàn)阿膠特征離子峰；但是，2批馬皮膠自制口服液檢測出阿膠對照特征峰，新建方法對馬皮膠摻假檢測敏感度低，需結(jié)合其它方法進行檢測（圖3）。

2.2? 紅外光譜分析? 以BKr粉末3.0mg，紅外光燈下研勻，并均勻放入壓片磨具內(nèi)，施壓制片，制得均勻透明的空白片，取出后，分別精密吸取樣品溶液約0.1mL，做紅外指紋對比分析。設(shè)定掃描次數(shù)16次，分辨率4cm-1，取樣品壓片在4000～400cm-1下進行測定［8］。由紅外光譜分析結(jié)果可觀察到膠質(zhì)氨基酸在1400～1700cm-1及3400～3600cm-1 處有顯著的特征吸收峰，前者為C=O基和芳香環(huán)基團所在，后者為-NH-基團所在，圖譜結(jié)果可知馬皮膠口服液在兩個頻率范圍內(nèi)，吸收頻率，強度及峰型均與阿膠強骨口服液有顯著的差異。

3? 討論

阿膠為馬科動物驢Equus asinus L.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。《本草綱目》載：“古方用者，多牛皮，后世乃貴驢皮，當(dāng)以黃透如玻珀色，或光黑如漆者為真”［8］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究［9］表明阿膠主要含有膠原蛋白α1和α2 （64.65% ）、蛋白質(zhì)多肽、糖胺聚糖類物質(zhì)及其它微量元素組成，具有治療貧血，增強免疫力，抗休克，增強血管通透性，改善骨質(zhì)鈣代謝和抗疲勞等諸多作用。阿膠強骨口服液是以阿膠為主藥的治療骨質(zhì)疏松性中成藥，其阿膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究對原料甄選，產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要意義。

阿膠的鑒別方法已由傳統(tǒng)簡單的性狀鑒別，發(fā)展為現(xiàn)代生物標(biāo)記物法，DNA標(biāo)簽、液相色譜法等，但是這些方法均有缺點。如阿膠強骨口服液已采用高效液相法對阿膠L-脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸等進行含量控制，但對比研究發(fā)現(xiàn)該方法對控制雜皮膠缺乏專屬性［10］。在阿膠強骨口服液阿膠成分超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法方法建立上本試驗參考了陳佳等［11］建立的方法，在前處理方法上改用序列分析用胰蛋白酶，以提高樣品處理外源引入雜質(zhì)；在液相方法上提高進樣量為10μL，毛細管電壓由4 kV調(diào)整為3 kV，錐孔電壓由40 kV修改為30 kV，除溶劑氣體為由600L/hr 降為500L/hr，在該條件下不同膠質(zhì)峰形和強度都有所提高。從試驗結(jié)果看，阿膠強骨口服液中阿膠成分的質(zhì)譜檢測方法對同為馬科奇蹄目的馬皮膠專屬性不高，因此本試驗補充了紅外光譜法對阿膠強骨口服液摻馬皮膠進行鑒別。在紅外譜分析中，與以往報道［12］結(jié)果對比，本研究發(fā)現(xiàn)在1400～1700cm-1和3400～3600cm-1 頻率范圍，馬皮膠口服液吸收頻率，強度及峰型與阿膠強骨口服液相比均有顯著的差異，此處為羰基和亞氨基伸縮震動區(qū)域，采用紅外光譜技術(shù)可以有效的區(qū)別阿膠強骨口服液和偽阿膠強骨口服液［13］，可推測馬皮膠經(jīng)裂解后的肽鍵分裂程度與驢皮膠完全不同。此外，阿膠在3000cm-1附近頻率段出現(xiàn)高震現(xiàn)象，其中2926cm-1頻率處的紅外吸收峰歸屬于CH2 不對稱伸縮振動模式，而 2855cm-1頻率處的紅外吸收峰則歸屬于 CH2對稱伸縮振動模式［14］。推測為阿膠中苯丙氨酸芳環(huán)上的C—H鍵（σAr-H）及骨架中的（σC=C）伸縮震動引起，這可能和阿膠氣味芳香強于其它膠質(zhì)的原因有關(guān)。

參考文獻

［1］國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正（中藥）頒布件 ［J］. 中國藥品標(biāo)準(zhǔn)， 2010， 76： 68-69.

［2］國家食品藥品監(jiān)督管理總局．阿膠中牛皮源的補充檢驗方法［Z］．國家食品藥品監(jiān)督管理局補充檢驗方法和檢驗項目批準(zhǔn)件，編號2012001，2012.

［3］ 國家食品藥品監(jiān)督管理總局．鹿角膠補充檢驗方法［Z］．國家食品藥品監(jiān)督管理局補充檢驗方法和檢驗項目批準(zhǔn)件，編號2014014，2014.

［4］黃飛燕，李曉君，張國昌，等.超高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測婦舒丸中阿膠特征肽及牛皮源成分［J］.云南化工，2022，49（7）：54-57.

［5］陳佳，程顯隆，魏鋒，等.超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測復(fù)方阿膠漿中阿膠［J］.藥物分析雜志，2015，35（2）：328-332.

［6］張靜嫻，胡青，董洪霜，等.超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法用于阿膠糕類食品中阿膠的鑒別及馬、牛、羊、豬皮源成分的檢測［J］.世界中醫(yī)藥，2019，14（4）：828-832.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部） ［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社.2020：197.

［8］李時珍．本草綱目（下） ［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，1982，獸部：319.

［9］郭中坤，王可洲，籍國霞，等. 阿膠的成分、鑒別方法及藥理作用研究進展［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，17（4）：71-74.

［10］林曉伊，李亙，王馮宇，等.阿膠及其制品質(zhì)量檢測方法研究進展［J］.食品與機械，2021，37（7）：207-212.

［11］程麗，汪婷，武嘉林.HPLC法同時測定阿膠強骨口服液中4種氨基酸［J］.中成藥，2017，39（3）：636-639.

［12］許長華，周群，孫素琴，等. 二維相關(guān)紅外光譜法與阿膠的真?zhèn)舞b別［J］. 分析化學(xué)， 2005，33（2）：221-224.

［13］陳麗云，甄璐靜，紀(jì)碩，等.東阿阿膠紅外光譜研究［J］.山東化工，2019，48（4）：75-78.

［14］LI W L， HAN H F， ZHANG L， et al. Manufacturer identification and storage time determination of “Donge Ejiao” using near infrared spectroscopy and chemometrics［J］. J Zhejiang Univ Sci B. 2016，17（5）：382-390.

（收稿日期：2023-03-23? 編輯：劉? 斌）