circ_PITX1/miR-129-5p對食管癌細胞增殖凋亡及放射敏感性的影響

陳會 廖威麟 鄭軼峰 廖世均 代婷婷

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，放射治療是其主要治療方式，放療抵抗影響其治療效果，研究表明多種基因可影響食管癌的放射敏感性，放療聯合靶向藥物治療能夠提升治療效果，減少并發癥和不良反應，因此，篩選影響放射敏感性基因對開發靶向藥物聯合放療具有重要意義[1-3]。研究報道miR-129-5p食管鱗狀細胞癌中下調表達，miR-129-5p作為一種食管鱗狀細胞癌的抗癌miRNA，具有抗增殖和促凋亡的作用[4]，并使非小細胞肺癌細胞對放射敏感[5]。miR-129-5p可作為circTHBS1靶標參與其促進非小細胞肺癌細胞增殖并抑制凋亡的過程[6]。生物學軟件預測發現miR-129-5p與circ_PITX1有結合位點。研究報道circ_PITX1在膠質母細胞瘤中上調，circ_PITX1下調會阻礙細胞增殖并加速細胞凋亡[7]。敲低circ_PITX1抑制糖酵解以通過miR-329-3p/NEK2軸增強神經膠質瘤細胞的放射敏感性[8]。而circ_PITX1對食管癌細胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響尚不清楚。本實驗旨在探討circ_PITX1對食管癌細胞增殖凋亡及放射敏感性的影響及分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2018年1月至2021年1月51例食管癌患者癌組織及癌旁組織，患者手術前未進行過放化療，患者均知情且同意。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 細胞與主要試劑 食管癌細胞EC109(美國ATCC)；RPMI-1640培養基(美國Gibco)；Trizol試劑、Lipofectamine TM 2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；SYBR Green試劑盒(日本Takara)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑(美國Sigma)；cDNA Synthesis Kit(德國Roche)；Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒(上海Yeasen)；增強型化學發光試劑盒(美國Millipore)；pMIR-REPORT載體(美國Promega)。

1.3 細胞處理與分組 細胞EC109常規培養于RPMI-1640培養基，將circ_PITX1干擾表達載體及miR-129-5p抑制劑分別轉染至EC109細胞，記為干擾circ_PITX1組、miR-129-5p Inhibitor組，常規培養的細胞作為對照組；用2 Gy射線照射EC109細胞，記為2 Gy組，circ_PITX1干擾表達載體轉染至EC109細胞用2 Gy射線照射，記為2 Gy+干擾circ_PITX1組；將circ_PITX1干擾表達載體及miR-129-5p抑制劑共轉染至EC109細胞，記為干擾circ_PITX1+miR-129-5p Inhibitor 組，然后用2 Gy射線照射，記為2 Gy+干擾circ_PITX1+miR-129-5p Inhibitor組。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測circ_PITX1和miR-129-5p表達水平 Trizol試劑提取食管癌樣本、EC109細胞總RNA，cDNA Synthesis Kit合成cDNA，SYBR Green與特異性引物混合，進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。以β-actin和U6為內參，circ_PITX1 F：5’-GCGTCCCTGTGTATGTTGGA-3’，R：5’-GCCGGCAGAGTCTGTCTTAAA-3’；β-actin F：5’-GACCTCTATGCCAACACAGT-3’，R：5’-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3’；miR-129-5p F：5’-CTTTTTGCGGTCTGGGCTTGC-3’，R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6 F：5’-CAGCACATATACTAAAATTGGAACG-3’，R：5’-ACGAATTTGCGTGTCATCC-3’。

1.5 MTT檢測細胞增殖抑制率 將各組EC109細胞接種到96孔板，48 h后，將細胞孵育20 μl MTT溶液(5 mg/ml)4 h，二甲基亞砜充分溶解結晶后，在酶標儀490 nm處測量吸光度(OD)值；計算抑制率。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 培養48 h后從6孔板中收獲各組EC109細胞。采用Annexin V-FITC和PI染色。

1.7 克隆形成實驗檢測細胞克隆數 將各組EC109細胞在6孔板中接種(100個/孔)，并在37℃下培養14 d。然后將克隆細胞固定并用結晶紫染色。顯微鏡下對克隆細胞拍照，計數(>50個細胞)。

1.8 蛋白質印跡(Western blot)法檢測蛋白表達 各組EC109細胞用RIPA裂解緩沖液處理以提取總蛋白。定量后，蛋白進行SDS-PAGE凝膠，轉移到PVDF膜，然后用脫脂牛奶孵化。將膜與靶向Cleaved-caspase3(1∶1 000)、Cleaved-caspase9(1∶1 000)或GAPDH(1∶2 000)的一抗4℃過夜，與二抗(山羊抗兔IgG，1∶10 000)室溫培養1 h。使用增強型化學發光試劑盒顯現蛋白印跡。

1.9 雙熒光素酶報告實驗 將包含miR-129-5p的假定結合位點或突變位點的circ_PITX1片段克隆到pMIR-REPORT載體中，生成野生型(WT)或突變型(MUT)報告載體WT-circ_PITX1或MUT-circ_PITX1。將報告載體與miR-NC或miR-129-5p共轉染至EC109細胞并孵育48 h。通過雙熒光素酶報告基因檢測系統評估熒光素酶活性。

2 結果

2.1 不同組織circ_PITX1和miR-129-5p表達 食管癌組織中circ_PITX1比癌旁組織增加(P<0.05)，miR-129-5p比癌旁組織減少(P<0.05)。見表1。

表1 不同組織中circ_PITX1和miR-129-5p表達

2.2 沉默circ_PITX1對EC109增殖凋亡放射敏感性的影響 與對照組比較，干擾circ_PITX1組EC109細胞抑制率和凋亡率升高，克隆數減少，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9水平升高(P<0.05)；與2 Gy組比較，2 Gy+干擾circ_PITX1組EC109細胞抑制率和凋亡率升高，克隆數減少，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9表達升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 沉默circ_PITX1對EC109克隆凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響；A沉默circ_PITX1對EC109凋亡相關蛋白表達的檢測；B沉默circ_PITX1對EC109凋亡的檢測；C沉默circ_PITX1對EC109克隆形成的檢測；1 對照；2 干擾circ_PITX1；3 2Gy；4 2Gy+干擾circ_PITX1

表2 沉默circ_PITX1對EC109增殖凋亡放射敏感性的檢測

2.3 抑制miR-129-5p對沉默circ_PITX1處理的EC109增殖凋亡放射敏感性的影響 與干擾circ_PITX1組比較，干擾circ_PITX1+miR-129-5p Inhibitor 組EC109細胞抑制率和凋亡率降低，克隆數增多，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9表達降低(P<0.05)；與2 Gy+干擾circ_PITX1組比較，2 Gy+干擾circ_PITX1+miR-129-5p Inhibitor組EC109細胞抑制率和凋亡率降低，克隆數增多，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9表達降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 抑制miR-129-5p對沉默circ_PITX1處理的EC109克隆凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響；A 抑制miR-129-5p對沉默circ_PITX1處理的EC109凋亡相關蛋白表達的檢測；1干擾circ_PITX1；2干擾circ_PITX1+miR-129-5p Inhibitor ；3 2Gy+干擾circ_PITX1；4 2Gy+干擾circ_PITX1+miR-129-5p Inhibitor;B 抑制miR-129-5p對沉默circ_PITX1處理的EC109凋亡的檢測；C 抑制miR-129-5p對沉默circ_PITX1處理的EC109克隆形成的檢測

表3 抑制miR-129-5p對沉默circ_PITX1處理的EC109增殖凋亡放射敏感性的檢測

2.4 沉默circ_PITX1或抑制miR-129-5p處理后轉染效率的檢測 與對照組比較，干擾circ_PITX1組circ_PITX1表達水平降低，miR-129-5p Inhibitor組miR-129-5p表達水平降低(P<0.05)；表明轉染成功。見表4。

表4 circ_PITX1和miR-129-5p表達的檢測

2.5 circ_PITX1靶向調控miR-129-5p Starbase預測顯示circ_PITX1和miR-129-5p互補序列；miR-129-5p與WT-circ_PITX1共轉染的細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)；與對照組比較，干擾circ_PITX1組miR-129-5p表達水平升高(P<0.05)。見圖3，表5、6。

圖3 circ_PITX1靶向調控miR-129-5p；A circ_PITX1和miR-129-5p互補序列；B 雙熒光素酶報告實驗；C circ_PITX1調控miR-129-5p的表達

表5 雙熒光素酶活性

表6 circ_PITX1調控miR-129-5p的表達水平

3 討論

放射治療是食管癌的一種重要治療方式，放療聯合靶向藥物治療食管癌的臨床療效確切；了解影響放射敏感性的具體基因分子，有針對性的采取干預措施對提高放療效果至關重要[9-11]。研究報道circ_PITX1通過調節miR-1248/CCND2軸促進非小細胞肺癌的進展[12]。敲除circ_PITX1通過靶向miR-584-5p/KPNB1軸，抑制人膠質母細胞瘤細胞的體內增殖、血管生成、遷移、侵襲和腫瘤生長[13]。本研究數據顯示，食管癌組織中circ_PITX1高表達，推斷circ_PITX1與食管癌發生發展有關。沉默circ_PITX1后，EC109細胞抑制率和凋亡率升高，克隆數減少，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9表達水平升高；表明沉默circ_PITX1可抑制EC109細胞增殖，促進細胞凋亡。沉默circ_PITX1聯合2 Gy射線照射時EC109細胞抑制率和凋亡率顯著高于單獨2 Gy射線照射，且克隆數低于2 Gy射線照射；提示沉默circ_PITX1可能增強EC109細胞對射線的敏感性。

研究報道miR-129-5p可通過靶向HMGB1抑制自噬并降低乳腺癌細胞的放射抗性[14]。miR-129-5p過表達通過調節YWHAB促進依托泊苷誘導的肺癌細胞凋亡[15]。miR-129-5p可以通過靶向PBX3，在胰腺癌的進展和發展中作為腫瘤抑制因子[16]。本實驗檢測到食管癌組織中miR-129-5p表達水平降低，與文獻[4]結果一致。且本實驗發現circ_PITX1靶向調控miR-129-5p的表達，而抑制miR-129-5p可逆轉沉默circ_PITX1對EC109細胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響。提示circ_PITX1可能通過調控miR-129-5p影響EC109細胞增殖、凋亡及放射敏感性。

綜上所述，沉默circ_PITX1可通過上調miR-129-5p抑制食管癌細胞增殖，促進細胞凋亡及增強細胞的放射敏感性。